3.2 成体干细胞ASCs
3.2.1 MSCs
MSCs包括骨髓间充质干细胞(, BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和脐带血间充质干细胞(UBMSCs),BMSCs可避免免疫排斥反应,能够在体外大量扩增,还具有免疫调节和旁分泌效应,在视网膜疾病的治疗中得到了广泛的应用[9,14]。通过无创静脉注射MSCs的方式可对RCS大鼠进行治疗,发现术后视网膜感光细胞层厚度较对照组显着增加,视力改善,异常血管复合物和血管渗漏减少。RT-PCR和免疫组织化学检测提示眼内生长因子和神经营养因子表达量增加,该方法操作简便,患者耐受性好,可以反复多次治疗,是一种理想的治疗研究方向[17]。临床试验中应用较多的是BMSCs,BMSCs虽然来源于中胚层,但它具有向其他胚层以及中枢神经元和视网膜细胞分化的能力,已用于心肌梗塞、肝硬化、脑梗塞、AMD、糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)、视网膜静脉阻塞(retinalvein occlusion, RVO)、RP、遗传性黄斑变性、遗传性视网膜营养不良、视神经疾病、青光眼等多种疾病的临床研究。Jonas等尝试对1例DR玻璃体切割术后的患者进行自体BMSCs玻璃体腔注射,术后安全性好,但对视力没有改善[18]。目前多数研究都采用了BMSCs悬液视网膜下腔或玻璃体腔注射(10×106cells/ 0.1ml )的方式,前者手术创伤较大,重复治疗受限;后者有潜在的玻璃体腔内细胞增生的风险。美国的一个研究小组用巩膜脉络膜插入微管的方式将人脐带组织来源干细胞(humanumbilicaltissue-derived stem cells,hUTSCs)细胞系CNTO2476悬液移植到干性AMD患者视网膜下腔,目前还没有I/II期临床试验的研究报道[19]。
迄止目前,关于MSCs能够分化为视网膜细胞的证据尚不充分,其发挥治疗作用的机制还有待进一步研究。大多数基础研究表明,BMSCs在体内难以向神经元和视网膜细胞分化,其改善视网膜功能的作用更可能是通过其抗炎、免疫调节、神经营养来实现的[16]。
3.2.2 其他来源的ASCs
研究者还对其他多种ASCs进行了研究,包括视网膜前体细胞(retinalprogenitorcells, RPCs)、神经前体细胞(NPCs)、胎儿视网膜神经上皮层及RPE层移植片。
(1)RPCs
人RPCs体外分离扩增并移植到RCS大鼠视网膜下腔后12周,大鼠眼动反应性和视力较伪手术组显着改善,视网膜外核层厚度和细胞数量增加,提示人RPCs移植可延缓患者视力丧失的进程和视网膜形态的变化,可能与宿主感光细胞得到了保护有关。人RPCs移植后大鼠耐受较好,未见肿瘤形成等并发症[20]。我们实验室采用胚胎组织来源的人RPCs对RP患者进行视网膜下移植,术后随访1年,发现患者术后耐受较好,无免疫排斥反应等严重并发症,手术操作安全,患者视力得到一定程度改善。
(2)近年来研究发现,与中枢海马来源的NPCs相比,大脑皮质来源的神经前体细胞(CNPCs)具有更好的向RPE细胞分化的能力。CNPCs移植到RCS大鼠视网膜下腔后明显改善大鼠视网膜功能,并可持续270d。对正常猕猴行CNPCs移植后能够在视网膜下腔形成单细胞层,对视功能没有影响,也没有出现严重并发症[14]。StemCells公司正在进行人胎儿神经干细胞(HuCNS-SCs)悬液移植治疗干性AMD的I/II期临床试验,以评估其初步的疗效及长期的安全性[21]。
(3)胎儿视网膜神经上皮层及RPE层移植片
Aramant团队将9~16周的流产人胎儿视网膜神经上皮层及RPE层联合移植片植入到干性AMD或RP患者的视网膜下腔,随访1年后发现,4例干性AMD患者的视力均提高,6例RP患者中3例视力提高,1例视力稳定,2例视力下降;微视野的结果也证明了视功能改善。所有患者均未观察到免疫排斥反应[22]。
3.3 视网膜内源性干细胞
3.3.1 睫状缘干细胞
在视网膜周边与睫状体相连,具有原始干细胞/祖细胞存在的部位被称为睫状缘(ciliary margin zone,CMZ)。对鱼和两栖类动物的研究发现,CMZ干细胞分裂增生非常活跃,终生不断产生新的神经元整合到视网膜中,而鸡、鼠、人的CMZ干细胞处于休眠状态,仅在病理或损伤情况下才活化,但其分化的能力很有限,不能完成视功能的自我修复。将大鼠和小鼠的CMZ干细胞分离培养,均能够在体外形成克隆球,证实其具有自我更新的能力。胰岛素、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)-1、FGF-2、Shh(SonicHedgehog)等生长因子或信号分子能够在一定程度上支持CMZ干细胞的神经再生潜能,并诱导产生具有极性和吞噬功能的RPE样细胞。但是,如何在哺乳动物中在体激活这部分细胞并对其增生和分化进行调控目前仍是挑战,还需要进一步的研究[9,14,23-24]。
3.3.2 视网膜Müller细胞
Müller细胞成熟较晚,具有一定的RSCs祖细胞特征。Müller细胞是鱼类视网膜损伤后修复的最主要来源,可以完全再生视网膜神经元。哺乳动物Müller细胞也具有RSCs潜能,能够在FGF-2存在情况下体外增生形成克隆球,并向神经元分化,在视网膜损伤情况下也能够大量增生,产生新的视网膜神经元,替代缺失的细胞。移植的外源性干细胞,如RSCs、BMSCs,以及一些生长因子,如表皮生长因子和神经生长因等能够激活Müller细胞的神经再生潜能。根据损伤神经元和微环境的变化,Müller细胞能够分化表达多种视网膜神经细胞标志物,改善宿主视功能。但是,如何在哺乳动物中激活Müller细胞并对其增生和分化进行调控目前仍不清楚,Müller细胞的胶质化仍是影响其发挥干细胞/祖细胞特性的一大障碍[14,24]。
4、研究者应当继续关注的相关问题
眼科干细胞研究因其独有的优势,已成为目前干细胞基础研究和再生医学临床研究中备受关注的领域,目前已在世界卫生组织国际临床实验注册平台(InternationalClinicalTrials Registry Platform, ICTRP)以及美国国立卫生研究院(NIH)的ClinicalTrials.gov注册的多项临床试验已经证实眼科干细胞移植的安全性好,但其远期疗效是需进一步解决的瓶颈问题,一些临床试验已在病例招募阶段(表1)。随着国内外干细胞研究技术的进展和政府对相关研究支持力度的加大,干细胞移植治疗不可逆眼病的临床试验工作相继展开,我国眼科干细胞移植的临床研究也进入了新的阶段。眼科研究者应密切关注眼科干细胞移植研究的进展。
目前要进一步改进的研究包括:
(1)临床级低成本的稳定干细胞来源的种子细胞开发研究;
(2)微创、可重复的临床移植方法优化;
(3)干细胞移植后细胞的长期存活及免疫排斥反应的临床监测;
(4)移植细胞与宿主细胞的功能联系。同时,眼科干细胞移植与其他领域最新研究进展的交叉融合,如干细胞与基因治疗的联合、干细胞与组织工程支架研究的联合以及动员高等哺乳动物的内源性干细胞的方法研究,也将为干细胞移植技术的临床应用打开新的思路。
文/《中华实验眼科杂志》阴正勤 李世迎 |