中国首次基因治疗眼部疾病；基因治疗leber遗传性视神经病变
http://www.nature.com/articles/srep21587
以下文章翻译因为不是专业眼科人员翻译.因此如有错误请谅解
1. 摘要（人工翻译）
Leber氏遗传性视神经病变（LHON）是一种导致失明的线粒体遗传病 。在NADH脱氢酶亚基4（ND4）基因的11778碱基位点A线粒体DNA点突变是最常见的原因。本研究的目的是评估在携带G11778A突变LHON患者携带ND4（的rAAV2-ND4）的重组腺相关病毒2（AAV2）的疗效和安全性。通过玻璃体内注射到一只眼睛，有九个患者施用了rAAV2-ND4， 然后对他们进行9个月的跟踪。进行视力，视野，和光学相干断层成像的眼科检查。体检包括血常规，尿。经过9个月的随访发现，其中六名患者注射过的眼睛的视力有至少0.3 log MAR改善。在这六个患者中，视野被扩大，但视网膜神经纤维层保持相对稳定。其他的测量结果没有显著的变化。在9个月的随访期间，九个患者均无与向量相关的局部或全身不良事件。这些发现支持了LHON基因疗法的可行性。
2. 介绍（机器翻译）
Leber氏遗传性视神经病变（LHON）是已经在1871年由德国眼科医生西奥多Leber1首先描述神经变性线粒体病。主要临床症状是无痛急性或亚急性中央视力下降，或者同时或连续在两个眼睛。绝大多数患者在这两个eyes2少于2个log MAR（分辨率为最小角度的对数）的视力。
LHON是由线粒体DNA（mtDNA的）点突变引起的。三种最常见的这些突变（影响高达95％的患者）的发生在核苷酸在11778（G11778A）在NADH脱氢酶亚基4复杂位置11778，14484和34603.具体地，G-到的点突变电子传递链（也称为华莱士突变）4 I（ND4）基因是存在于LHON患者的60％worldwide5。之前我们已经表明，这种基因突变是目前在LHON患者在中国alone6的多达87.9％。
没有绝对适用于LHON有效的治疗。已经报道了艾地苯醌，辅酶Q10的短链衍生物，是治疗LHON7潜在剂，但它的处理效率是有争议的。艾地苯醌和维生素B12疗法被报道是有效的在一些patients8，但未能为others9,10。最新的研究表明，辅酶Q10和艾地苯醌，EPI-743，的对 - 苯醌类似物持有具有改进的药理学性质的承诺;有视觉function11,12,13几个测试参数的真正提高。尽管如此，在LHON的治疗新方法仍然需要explored14。
一个这样的替代方法是基因therapy15,16。然而，ND4是mtDNA-编码基因，转导和腺相关病毒2（AAV2）-ND4只能进入细胞核，线粒体不。为了解决这个问题，在本研究中，我们使用allotopic表达技术：我们基于由畜栏-Debrinski等al.17,18和报告的方法在核遗传密码重新编码它构造的线粒体ND4基因的核版本已经成功地应用于others19,20。在初步的临床试验中，有三例患者的视力最差的眼睛AAV2-ND4单单侧玻璃体内注射首次治疗。 9个月的随访期间，没有观察到副作用。所以后来，我们管理的AAV2-ND4基因治疗等六个病人。本文报道的发现提供了对使用基因治疗LHON指导。
3. 结果（机器翻译）
我们招收9确诊LHON患者在这个前瞻性研究。平均年龄19.22±11.57年的7男2女患者的 （表1） 。从注册的手术时间开始，九个患者的最佳矫正视力（BCVA）没有变化。眼科及全身检查进行手术前进行。常规血液和尿液检查;肝，肾，和免疫功能测试;和CD3 +，CD3 +/ CD4 +和CD3+ / CD8 +细胞计数均正常（补充图S1中，补充图S2）。抗AAV2中和抗体测定为阴性（补充图S3）。
患者1，2，并在2011年8 - 9月3接收基因疗法作为第一组患者，和患者4～9收到的基因治疗10 - 12月2012年为第二组患者。成功地进行了玻璃体的rAAV2-ND4注射在这些名患者。过程中或手术后没有观察到的并发症。
眼科检查
眼科检查进行玻璃体内注射后9个月的治疗和1，3，6之前进行，和。眼内压（IOP）和眼睛的前和后段没有显示出从之前改变到玻璃体内注射后（图1，补充图S4）。
视力
6例视力为9个月的随访后显著改善（最佳矫正视力的改善等于或大于0.3日志MAR）。患者1和4提高了他们的视力从2到1.1日志MAR，和患者1能够治疗后读报纸的头条新闻。患者2曾面临因严重低视力学习困难，但他的学习成绩与视力的改善（1.7至1.3日志MAR）以及治疗后明显好转。患者7从LHON遭受了17年，但注入眼睛的视力也从处理后1.2至0.8日志MAR提高。患者6（9岁的女孩）提高了她的视力从1.2到0.4日志MAR，她已经回到了学校与她的同学学习。有趣的是，与LHON儿童被报道具有不利prognosis21。患者8改进了他的视力由眼科检查确定，但患者出现没有改善（1.7至1.4日志MAR）。值得一提的是，患者3的注入眼睛的视力的小改进（从1.2到1个log MAR），和改进没有达到最小0.3 logMAR为。患者5并未出现视力任何起色，原因不明。平均视力为1.69±0.43治疗前。平均BCVAs为1.58±0.44，1.38±0.46，1.23±0.60，1.27±0.58在1，3,6和治疗后9个月，分别（图2，表2）。
视野
玻璃体内注射后的一个月，患者1，4和6中报告在其视野的改进。意味着注入眼睛的视野指数（VFI）是玻璃体内注射前0.16±0.18，和0.28±0.23，0.31±0.23，0.27±0.22，和0.27±0.22在月1，3，6和9玻璃体内注射后，分别（图3和4）。注入的眼睛的平均缺陷（MD）在玻璃体内注射后6和9个月（图3和5）进行了改进。患者2拒绝了视野测试。
VEP
VEP结果显示P100波的部分患者注射的眼中的潜伏期缩短（一P100波<105毫秒是正常的）。在玻璃体内注射后的6个月内，注射的眼中的P100振幅均增加，但VEP结果不稳定（补充图S5）。
OCT和电图（ERG）
十月揭示了在名患者的视网膜神经纤维层（RNFL）厚度在上级，鼻，颞象限从之前没有显著变化，并以玻璃体内注射后（补充图S6）。
患者2，3，6人太年轻，经历ERG，和患者5和8拒绝接受ERG。因此，病例数太少，我们没有的ERG值的记录。
全身检查
全身身体检查是在九个患者体内注射后6个月进行的前和1，3和。常规的血液和尿，以及肝，肾，和这些名患者的免疫功能测试的结果均正常。
CD3 + / CD4 +和患者1,2 CD3 + / CD8 +和9的检测值比正常值（补充图S1）低。半年后，CD3 + / CD4 +和CD3 + / CD8 +细胞计数在这些患者恢复正常。
血清AAV2，ND4，和干扰素（IFN）的浓度-γ的患者进行酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。相比手术前的值，血清AAV2，ND4，和IFN-γ的浓度不显著在月1，3 6处理后改变，和。
前和1治疗后一个月，患者1和2 AAV2中和抗体测定显示AAV2 1时20分的血清浓度和无血清AAV2之间的差。然而，处理3和6个月后，该名患者的中和抗体测定的结果是不是AAV2 1点20分的血清浓度和无血清AAV2之间不同。平均值分别为0.93±0.10，0.86±0.26，玻璃体内注射（补充图S3），0.92±0.04，和前0.96±0.07和1，3和6个月后。
4. 讨论（机器翻译）
在本研究中，我们施用的rAAV2-ND4的单剂量玻璃体内注射到九LHON患者。我们发现的rAAV2-ND4有治疗LHON的潜力。没有玻璃体内注射相关的不良事件或其他并发症发生在这些名患者。
玻璃体腔内腺相关病毒注射ND4的安全性是由之前的标准检查和治疗保障。我们选择了用于基因治疗的那些患者具有负抗AAV2中和抗体测定。之所以这样选择是，抗AAV2抗体可以抑制AAV2-ND4的在视网膜中的表达，这可能导致的免疫应答。我们药的患者口服泼尼松龙一周治疗前和两个月之后，以避免通过基因疗法诱导的潜在严重的免疫应答。术后6个月，这名患者的中和抗体测定的结果均为阴性，这表明该单剂量玻璃体内AAV2-ND4注射全身反应是温和的。据报道，一种AAV2诱导的免疫反应密切相关，在CD8 + cells22,23增加。因此，我们招募患者正常CD3 +，CD3 + / CD4 +和CD3 + / CD8 +细胞计数，按照布里奇等al.16的做法。
在我们的研究中，注入的眼睛的视力，主要改善在处理后的第三和第六个月。此外，我们发现，患者2和3所注入的眼睛的视力治疗后没有改善持续1年。
LHON通过在线粒体DNA点突变，这导致在线粒体呼吸链的复合物I NADH脱氢酶活性降低，并因此由线粒体中能量产生的减少而引起的。由于视神经组织需要更多的能量比其他组织，它成为严重受损时，能源生产下降，并在视神经细胞的病理变化，甚至萎缩可以occur24,25,26。对本研究的结果，似乎是合理的假设，基因治疗供给正常ND4到线粒体，并且因此能量供应增加视神经。视神经组织的微生改进，使得光学功能可能的恢复。在这些患者中的光学功能的提高程度主要取决于残留视神经和视网膜神经纤维层的功能的程度。因此，在LHON患者视力的损失有关的视神经的条件，而不是疾病的持续时间。例如，病人从7 LHON遭受了17年，她的视力在接受治疗后好转显著。患者4从LHON遭遇了9年，他深刻的视力改善。
目前的研究结果表明，单剂量玻璃体内的rAAV2-ND4注射可安全有效。这项研究的一个限制是小样本的大小和其产生的结果的初步性质。一位长期，多中心，大样本大小的研究是必要的，以确认LHON基因疗法的潜力。
5. 方法（人工翻译）
rAAV质粒(该重组腺相关病毒载体)的构建
原始的载体由北京FivePlus分子医学研究所有限公司制作和纯化。rAAV 质粒（重组腺相关病毒质粒）依据[文献17，18]介绍的方法构建，由[文献27]详细说明。驱动ND4基因表达的是CMV启动子。简要地说，我们首先合成的DNA序列编码COX10 MTS-ND4-COX10 3'UTR分为两部分：COX10 MTS-ND4（包括在COX10 5'端+ COX10 MTS-ND4的CDS序列的线粒体定位信号序列1）和COX10 3'UTR（序列2）。 KpnI位点导入序列1的5’端部，SalI位点导入3'端 。SalI位点的5'端被引入到序列2; BamHI位点插入3'端。然后在两个序列里插入质粒pAAV2neo载体，一次一个。重组质粒经酶切审议并命名为pAAV2neo-COX10-ND4-COX103'UTR。该COX10 MTS是21个氨基酸长。因此，该融合蛋白具有成熟COX10多肽（MAASPHTLSSRLL TGCVGGSVW YLE RRT）的7个氨基酸。
在使用脂质体2000试剂盒（Invitrogen）的6孔板中进行的人胚胎肾（HEK）293细胞用pSNAV-ND4的转染。然后将这些细胞转移和培养在110×480平方毫米瓶（惠顿，惠顿，IL），并感染了HSV1-RC /ΔUL2（吴嘉河，中国北京，感染= 0.1复数）当细胞数达到8×108然后将细胞培养48小时后，间250用于进一步纯化毫升费恩巴赫培养烧瓶划分。所述的rAAV2-ND4病毒纯化，并使用逆转录（RT）-PCR识别。采用原位杂交与地高辛标记的巨细胞病毒探针的rAAV2-ND4的滴度（病毒基因组/毫升[VG /毫升]）检测。最终滴度为1×1011个VG /毫升。在以前的研究中，我们证实了在体外和在实验室animals28,29体内AAV2-ND4的玻璃体内注射的安全性和有效性。
患者
九例患者纳入这项研究。他们被诊断为LHON的携带基因检测的G11778A突变。基因测试在同济医院基因诊断中心（中国武汉市）进行。患者没有任何其他疾病的痛苦，也没有他们采取前一年内的任何药物。因为有4%的LHON患者G11778A突变会自发的恢复，为保证在研究期间的改善是完全由于基因治疗引起的，所有的参与者都 曾被诊断为一年以上，且它们的最佳矫正视力在前一年内没有改变; 不包括自发性视力恢复的患者。其他入选标准为：双眼视力<1.5 log MAR;年龄8-60岁;抗AAV2中和抗体测定为负数;并能够耐受基因治疗方法，其中包括局部麻醉。
排除标准如下：病人佩戴心脏起搏器或患有严重心脏病，肺或肾功能衰竭，出血任何急性传染病或精神疾病，发高烧，或心脏手术后还在痊愈; 患有慢性疾病，如糖尿病，高血压病;怀孕;参与任何其他的临床研究中的患者;患者的测试结果异常，如AAV2体液免疫反应为正（在AAV2中和抗体测定即抑制1:20血清样品的百分比是从该无抗体对照的显著不同）以及基因治疗手术前，出现T淋巴细胞子集CD3 +，CD3 + / CD4 +和CD3 + / CD8 +存在异常。基因治疗给药至眼与较差视力，或到右眼，如果视力在两个眼睛当量。
注册，知情同意和伦理批准
这项研究在ClinicalTrials.gov（;登记日，2010年12月注册号，NCT01267422）登记。我们的研究是根据对非行政许可审查和中国人民共和国国务院批准取消的决定进行的。该研究经鄂州市中心医院的伦理委员会同意，并且这项研究中所使用的方法是按照经批准的指导方针进行。每个病人及其监护人签署知情同意书。从按照赫尔辛基宣言每个受试者获得机构审查委员会的批准，并签署知情同意书。
学习规划
基因治疗包括给携带线粒体11778突变LHON的患者的眼球玻璃体腔内注射AAV2-ND4 ，以诱导ND4蛋白在患病部位 表达 。这项研究是一个开放性研究。
全身检查
基因治疗之前，所有患者均接受详细的全身体检。全身检查包括常规血液和尿液检查，以及肝，肾，和免疫功能的测试。患者静脉采血和人类T淋巴细胞亚群，即CD3 +（正常范围，50-84％），CD3 + / CD4 +（正常范围，27-51％）和CD3 + / CD8 +（正常范围，15-44％ ），进行计数。抗AAV2的中和抗体水平在华中科技大学同济医院检验医学学院进行分析。 AAV2，ND4，和IFN-γ的血清水平通过ELISA来确定。
在手术后1,3和 6月重复系统性检查 。
眼科检查
本研究的主要终点被定义为在视力恢复。次要终点被定义为视野，VEP和OCT结果的变化。
所有患者都进行了一个完整的眼科检查，包括视力，眼压，通过裂隙灯显微镜的眼前段检查，以及通过眼底镜的眼底检查 。狭缝灯显微镜和眼底镜检查是由相同的医生进行。
视力测试基于BCVA（最佳矫正视力），由相同眼科医生进行检查。眼图是2.5米的标准log MAR图（星康医疗科技有限公司，温州，中国），其中，每一条线表示0.3 log MAR 单位。在最佳矫正视力等于或大于0.3log MAR的变化被认为是显著。患者检查反复三次每次十分钟，以确认它们的视觉改善，平均值作为最终的视力。
用于确定眼压眼压仪是一拓普康-CT-80计算机化自动眼压计（TOPCOCN，东京，日本）。采用三次测量的平均值。
对于眼底（视网膜）摄影中，我们使用了自动对焦NIDEK眼底照相机，AFC-230（尼德克，东京，日本）。
汉弗莱场分析仪（卡尔蔡司740I，卡尔蔡司，上海，中国）被用于视野检查。测试过程包括中央30-2阈值测试和SITA快。主要记录的参数是VFI和MD。
对于VEP，用DV-100（上海Dikon医科大学，上海，中国）确定的P100波的价值以后，检查视神经的功能。该测试的眼睛光学矫正，和双眼观看条件获得通过。数据采集和分析与所连接的计算机来实现。
检查反转振幅接近100毫秒（P100）和前述负峰值的第一主正峰之间的差。 P100的幅度被记录下来。主要结果测量包括P100波和从眼视神经传导信号的反应能力的潜伏期到大脑（值<105毫秒视为正常）的潜伏期。
视网膜神经节细胞功能与罗兰电子有限公司电图（克尔特尔恩，德国）检查。
华侨城用Spectralis®HRA +十月（海德堡工程，海德堡，德国）检查，并进行分析的视网膜血管的四个象限（底，上，左，右象限）RNFL厚度。 OCT的所有数据使用现有的软件进行自动计算。
所有的检查是由同济医院（武汉，中国）眼科之前相同的技术人员进行，手术前后的1，3，6， 9个月进行这些检查。
口服氢化波尼松（一种糖皮质激素）
如前所述，患者均被给予了9周一个疗程的口服氢化波尼松（一种糖皮质激素）。该方案决定：实施载体的前一周每天0.5毫克/千克，后一周每天1毫克/千克，第二和第三周每天0.5毫克/千克，第四和第五周每天0.25毫克/千克，以及这九周的最后三周每天0.125毫克/千克。为了防止治疗期间和治疗后潜在的严重不良事件，我们对可能发生紧急情况的患者建立了预防措施 。氢化波尼松（这种激素）对LHON无效。
玻璃体腔内注射rAAV2-ND4
该手术是在手术室中进行。瞳孔放大后，患者固定在手术台，用0.1％盐酸奥布卡因滴眼液来麻醉合适的眼。使用1毫升注射器，注入针头是30G。注射部位是在角膜缘颞外3.5毫米。当通过瞳孔可以看见针头时，注射rAAV2-ND4。根据我们以前在实验室动物身上和参考文献里得到的经验，我们选择了比用于先天性黑蒙的基因治疗低的剂量。患者年龄小于12岁时剂量为5×109 VG / 0.05 mL，患者年龄大于12岁时，剂量为1×1010 VG / 0.05 mL 。为安全起见， 年龄小于12岁的儿童接受一半的剂量。 |
