【综述】
失明，尽管不是一种会威胁生命的疾病，但会削弱一个人的能力并且几乎不存在治愈的方法。眼部疾病的基因疗法将会深刻影响遗传性视网膜疾病患者的生活质量。正因如此，这个领域吸引了大量的研究去开发相应的疗法。有几个因素使得眼睛成为基因替换疗法的理想器官，包括易接近性、免疫豁免、体积小、组织分区和天然的对侧对照。本文将会对以下几个方面进行全面的论述：（1）处于临床试验阶段的基因疗法；（2）在各种视网膜疾病动物模型上进行临床前疗效与安全性试验并且结果表明这些方法有很好的临床应用潜力的基因疗法。为了尽量全面完整，我们还收录了其他概念验证试验，使用基因替换、神经营养/神经保护、光遗传学、抗血管生成或抗氧化压力策略进行治疗的实验。本文的补充材料还论述了眼基因治疗领域目前面临的挑战和未来发展的方向。
引言
眼睛是一个复杂的感觉器官，它进化而来既为了提高生存率又使得我们可以感知周围世界的秩序和美丽。Rodieck在The First Steps in Seeing一书的序言中写到："视觉感受能力是如此迅速而有力，语言只能为其作只言片语的注解；亲眼目睹能够让你联想，让你理解，让你注意，让你感知，让你获得第一手资料，让你预见未来。"不难理解，由于遗传或后天视网膜病变造成的视力缺失会显着影响一个人的生活，甚至差不多毁了患者的生活。在过去几十年里，视觉科学家通过研究已经阐明了这些疾病背后的分子机制。这些知识再加上对患者的临床诊断使得大量遗传和后天视网膜疾病的基因替换策略的迅猛发展。本文综述了用于治疗几种遗传性失明的基因疗法的早期临床试验和各种各样的临床前试验，这些临床前试验在视网膜疾病的动物模型上取得了显着的功能改进和/或视网膜结构再生稳定。我们关注的是表现出在不久的将来有最大临床应用潜力的疗法。其他策略，如基因替换、神经营养/神经保护、光遗传学、抗血管生成或抗氧化压力，和眼疾基因治疗领域目前面临的挑战和未来发展的方向在本文的补充材料中。
临床试验中
MERTK相关的常染色体隐性视网膜色素变性
Mer受体酪氨酸激酶（MERTK）是Axl/Mer/Tyro3受体酪氨酸激酶家族的一员。RPE吞噬光感受器外段碎片需要MERTK的参与，如果缺少MERTK，将导致视网膜严重变性。MERTK相关的常染色体隐性视网膜色素变性非常罕见，只在中东的偏远地区出现，最近还在法罗群岛被发现。皇家外科医学院大鼠最早于1938年由Bourne及其同事引进，是隐性遗传的视网膜变性的常用动物模型。视网膜变性的起因是RPE无力吞噬光感受器外段碎片，导致视网膜下出现碎片野和光感受器的凋亡。经ERG鉴定，视网膜变性还伴随着进行性视网膜功能衰退。2000年时，皇家外科医学院大鼠视网膜营养不良位点被确认为MERTK基因。随访研究发现常染色体显性视网膜色素变性（ADRP）患者带有纯合型的MERTK突变，有力地证明了MERTK与这一疾病的关系。对皇家外科医学院大鼠进行的援救实验包括基因替换以及添加神经营养因子，其目的是阻止变性和/或保全视网膜。在基因替换实验中，利用了腺病毒、AAV和慢病毒。这些早期实验中最成功的利用了表达MERTK的慢病毒，在注射后7个月依然能保全大量的视网膜功能。有意思的是，同时施加慢病毒－Mertk和表达胶质细胞源性神经营养因子的AAV比单独使用慢病毒－Mertk更有效。最近，AAV8 Y-F 衣壳突变载体被发现可保全皇家外科医学院大鼠的视网膜结构和功能，其效果至少在治疗后1年依然有效。据推测是因为AAV8 Y-F载体起效快、治疗介入时期早（出生后2天），导致明显的碎片野形成之前MERTK功能得到恢复，因此无需添加神经营养因子以阻止光感受器的凋亡。一项借助AAV2载体的I期临床试验目前正在沙特阿拉伯开展（NCT014822195；clinicaltrials.gov），该试验中AAV2载体表达RPE特异的MERTK启动子，载体由佛罗里达大学生产。到此文撰写之日为止，3位患者已接受了视网膜下注射，无不良事件发生（F. Alkuraya和E. Abboud，私人交流，2012）
临床前
常染色体显性视网膜色素变性
常染色体显性视网膜色素变性（ADRP）的发生至少和22种基因突变有关。这种疾病主要有以下三种发病原因：单倍不足，显性失活或毒性功能获得。单倍不足是指一个野生型的等位基因所表达的蛋白量不足以维持正常的生理功能。显性失活突变通常会干扰正常蛋白的功能，使其无法行使正常的功能或形成正常的多聚体。其中，ELOVL4突变是致病的主要原因。毒性功能获得是指机体创造出了对自身有害的蛋白。视网膜中的一个实例是视紫红质（RHO）的Q344ter突变，该突变导致视紫红质错误地定位在视杆细胞的细胞体上。
如果是单倍不足导致的ADRP，基因治疗时需要转入一段野生型的cDNA从而使得正常蛋白的浓度足以保证视网膜的生理健康。Cai等人使用了压缩DNA纳米颗粒治疗视网膜变性小鼠模型的PRPH2的显性功能丧失突变。然而，基因治疗显性失活突变或毒性突变会更复杂，因为显性等位基因可能需要被沉默。几组实验使用小干扰RNA技术包括核酶和RNA干扰来抑制突变产物的生成。例如，在一个由视紫红质P23H突变造成的大鼠ADRP模型中，用带有等位基因特异的发夹状和锤头状核酶的AAV载体转染，结果发现治疗后六个月内光感受器的形态和功能（ERG）得到恢复，提示该转染方法有长期的疗效。而突变特异的沉默最大的障碍是等位基因的异质性。突变的RHO基因就多达100多种，为每种突变都生成特异的抑制序列是不太可能的。正因为如此，一种突变不依赖的方法应运而生。这种方法中，核酶，最近改进为siRNA，被设计成针对不受突变影响区域的mRNA，这样野生型和突变型RNA都被降解了。因为RNA抑制剂（核酶，siRNA，或合成的miRNA）单独使用会导致视网膜变性，因此它们必须与转运和表达cDNA的载体一起使用，这些载体必须能够抵抗沉默突变的作用，因为同时转染的核酶或siRNA可能会使它们本身被沉默。Millington-Ward等人最近将AAV2载体共同注射到带有P347S突变的转基因小鼠体内，结果显着减缓了视网膜变性的速度。Mao等人表明向P23H小鼠行视网膜下注射一种siRNA，这种siRNA针对的是小鼠的Rho和人P23H RHO mRNA以及一种RHO抗性基因，它们都装载在一个AAV载体中，结果表明可以长期（9个月）恢复视网膜的功能和保留视网膜的结构。
除了通过降解突变的mRNA抑制基因表达，Mussolino和他的同事使用锌指转录因子来抑制P347S视紫红质转基因常染色体显性视网膜色素变性模型小鼠蛋白质的合成。将人的突变基因沉默后，注射AAV部位的视网膜的光感受细胞的存活率和功能显着提升。通过减小目标基因启动子的大小（如人RHO），抗性野生型基因可以与锌指蛋白共同转染。
然而，"抑制和取代"的基因治疗策略可能还不足以治愈RHO基因的显性突变。Mao等人最近向小鼠P23H人RHO基因突变ADRP模型进行单次注射带有野生型小鼠cDNA的AAV载体，ERG幅度和形态计量结果表明视网膜变性速度显着减缓。他们推论P23H一定是显性失活而非毒性功能获得突变，因为治疗能够为改变突变和野生型的视紫红质之间的平衡所影响。
蛋白质的错误折叠被认为是一大类视紫红质突变的发病机制，基因转导分子伴侣也是一种治疗ADRP的颇有前景的办法。 Gorbatyuk及其同事利用AAV载体增加Grp78的表达，Grp78是Hsp70家族的一员，位于内质网。结果表明，接受治疗的眼的ERG幅度和存活的光感受器明显增加。这种疗法与重新正确折叠的视紫红质水平的提高无关，而与未折叠蛋白的抑制有关。 |
