视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是遗传性盲目最常见的病因之一。由于RP患者视力持续性下降的原因是感光细胞的变性和凋亡，而感光细胞不能再生，移植健康的视网膜组织或者细胞，已经成为目前最具前景的治疗策略。已见报道的临床试验因供体组织或细胞来源差异较大，结果也不尽相同，但都未有突破性进展。2006年以来，多个视网膜移植中心的研究表明，处于特定时期的小鼠视网膜感光前体细胞可以与病变的视网膜建立突触联系，有效改善宿主视功能，这一开创性基础研究为视网膜移植临床试验指引了方向。根据这一研究成果，如果能在人胚胎发育过程中寻找到具有该特性的理想的RPP细胞，就有可能对临床视网膜移植带来推动作用。临床视网膜移植疗效判断不一致的另一主要原因是缺乏客观的视功能评价方法。因RP患者感光细胞功能微弱，常规的视觉电生理检查方法不能甄别受试者视功能的改变，只能借助于心理物理学检查。感光细胞的功能评价包括视锥细胞和视杆细胞两大部分，目前最敏感的多焦视网膜电图(multifocAlelectroretinogram，mERG)仅能有效反映部分RP患者的局部视锥细胞功能变化。探索利用mERG分离视锥和视杆细胞电活动，尝试对RP患者残存的视杆细胞的功能进行评估，可能有助于分析RP患者的视锥、视杆细胞功能变化规律。当RP 进一步发展，mERG 也难以检测到局部视网膜电活动。在哺乳动物(包括人类)非成像视觉传输系统中，外界光线照入眼内，会引起瞳孔短暂收缩。随着外界光线强度的增加，瞳孔的收缩幅度会逐渐增大，瞳孔收缩强度是反映视网膜和视神经功能的重要而灵敏的客观参数。但瞳孔收缩强度能否客观量化评估RP 病人感光细胞功能，尚未见系统研究。
动物实验表明，小鼠视网膜感光前体细胞存在一个约1周左右的窗口期，该期细胞具有一定的可塑性。如何在人胚胎中获得该特定时期的视网膜感光前体细胞是开展临床视网膜移植试验的前提，目前关于人胚胎视网膜感光细胞发育的生物学特性研究较少，如何分离获得胚胎感光细胞也仅仅在动物实验中开展。因此，研究人胚胎视网膜感光细胞发育变化，分离、纯化视网膜感光前体细胞，显得尤为重要。
综合上述研究和分析，本课题制定了“人胚胎感光细胞移植治疗视网膜色素变性的临床前研究”的试验方案，本试验方案获第三军医大学西南医院医学伦理委员会通过，并在世界卫生组织临床试验注册分部中国临床试验注册中心注册(注册号ChiCTR-TNC-00000193)。
试验内容和研究结果如下：
1建立了正常人视杆细胞mERG 记录技术并应用于RP患者视功能检测。结果发现，RP患者在常规闪光ERG呈熄灭型时，视锥mERG 仍可检录出有效波形，检出率为65.79％，而视杆细胞mERG 检出率为10.51％。RP患者的视锥细胞mERG 波描记阵列可以大致分为中心型、偏中心型和不可记录型。中心型的1、2 环振幅密度与中心视力呈正相关。
2 自主研制了全视野光刺激瞳孔记录仪。根据视杆细胞和视锥细胞的光刺激特征，采用短时程、渐进光亮度刺激RP患者视网膜，发现RP患者的瞳孔收缩强度均普遍低于正常人；RP患者瞳孔收缩的光亮度阈值越低，其各个光刺激水平的瞳孔收缩强度越高。在低亮度蓝光刺激下，瞳孔收缩强度与眼底自身荧光呈正相关；在中等亮度的白光刺激下，瞳孔收缩强度与视野呈正相关；结果提示：暗适应全视野刺激下的瞳孔收缩强度可以作为RP患者感光细胞功能的客观量化指标。
2 获得了高纯度的视网膜感光前体细胞。应用免疫组织化学方法，观察人视网膜发育阶段的感光细胞成熟标志物opsin的表达变化，发现opsin在胚胎第16周左右的视网膜外核层开始表达。随着视网膜发育成熟，其表达量逐渐增高。提示胚胎16周前的感光细胞处于前体阶段。采用弱酶消化、震荡分离、差速贴壁等方法从胚胎12-16周的视网膜中，获得了纯度达85％的人胚胎视网膜感光前体细胞；该细胞免疫细胞化学染色表现为：CRX、NRL、Tuj-1着色阳性，而opsin、Chx-10、GFAP 着色阴性。进一步发现，培养的视网膜感光前体细胞通过视黄酸体外诱导后，opsin表达明显升高。
3分别开展了6例同种异体人胚胎感光前体细胞和4例神经层视网膜细胞移植治疗RP的临床前试验。结果表明：人胚胎视网膜细胞移植治疗RP的手术操作成功率100％，围术期无任何并发症；术后玻璃体腔填充低浓度全氟丙烷(C3F8)有利于黄斑区视网膜平伏，避免细胞堆积于黄斑下。术后随访2～9月发现，RPP细胞移植组的供体在形态学上能很好地与受体组织长期融合，患者在移植后的2～6月的视力、视野、全视野光刺激瞳孔记录仪检查结果一致，均显示宿主视功能轻度改善。而神经层视网膜细胞移植组排斥反应率较高(75％)，排斥反应主要表现为术后1月的迟发变态反应，视功能明显受损。环孢素A和强的松联合用药，能有效缓解但不能终止排斥反应。试验表明，同种异体人胚胎感光前体细胞移植是安全的，移植后早期宿主视功能轻度改善。而神经层视网膜细胞移植则表现为较高的排斥反应。
综上所述，本课题得到如下结论：
1.建立了正常人视杆细胞mERG 记录技术。发现，mERG 可以分离RP患者视锥、视杆细胞功能，在常规闪光ERG呈熄灭型时，mERG能有效追踪、评判大部分RP患者病变的进程。
2．自主研制了全视野光刺激瞳孔记录仪，为RP患者提供了更为灵敏的视功能评价方法，瞳孔收缩强度可以作为RP患者残存感光细胞功能的客观量化指标。
３．确定了从人胚胎视网膜中分离视网膜感光前体细胞的“时间窗”。通过特殊的分离、纯化方法，获得了高纯度的视网膜感光前体细胞，且该细胞处于已经定向分化的前体阶段，而非多能干细胞并具有一定的可塑性，是目前视网膜移植中理想的“种子”之一。
4．开展了6例同种异体人胚胎感光前体细胞和4例神经层视网膜细胞移植治疗RP的临床前试验，手术操作成功率100％。发现视网膜感光前体细胞移植治疗RP是安全的，该移植物既没有成瘤性，也没有排斥反应，并在一定程度上改善了宿主视功能。而神经层视网膜细胞移植则表现为较高的排斥反应。这一成果为临床进一步开展有效性试验奠定了基础。
作者 刘勇
学科专业 眼科学
授予学位 博士
授予单位 第三军医大学
导师姓名 阴正勤 |
