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视网膜色素变性的基因治疗离我们有多远 李文生

本帖最后由 雪山飞狐 于 2010-1-18 14:30 编辑

视网膜色素变性的基因治疗离我们有多远

温州医学院附属眼视光医院  李文生


视网膜色素变性(视网膜色素变性,反相)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性最常见的遗传性致盲眼病,主要临床特征是:早期出现夜盲,进行性视野缩小,视网膜骨细胞状色素沉着,视盘呈蜡黄色萎缩和视网膜电图不能记录等。反相是临床上最常见且危害最严重的眼科遗传性疾病,位于遗传性致盲眼病的第一位,国外患病率为1 / 3500[1],而我国的患病率为三千七百八十四分之一[2],据此推算,我国反相病人总数约为45万,而在全世界范围内大约有反相患者150万,是当今造成失明的重症眼病之一。反相可表现出多种遗传方式,包括常染色体显性遗传(常染色体显性遗传视网膜色素变性,脂肪分化相关蛋白)约占30%,常染色体隐性遗传(常染色体隐性遗传视网膜色素变性,阿富汗农村重建方案)约占20%,X连锁遗传(X连锁视网膜色素变性,XLRP) 约占15%,还有约5%为反相的早发型,即隐性雷伯氏先天性黑蒙(雷伯氏先天性黑蒙,LCA的Ⅱ型),其余至少30%为散发型反相(零星,桑兰西),桑兰西 中大多数为阿富汗农村重建方案 或XLRP[3]。非综合征的反相包括所有反相的65%[3],还有20〜30%的反相以综合征的形式表现出来,可导致反相 的综合征有30 多种,包括常见的亚瑟综合征(尤塞氏综合症,先令)和Bardet Biedl综合征(Bardet Biedl综合症,论坛)等通常伴有反相[4],也严重影响患者视力。目前认为这些综合征中反相 的发病机制与原发性反相 相似。

反相的治疗方法包括药物治疗,基因治疗,干细胞和视网膜移植治疗以及人工视网膜的应用等,但是总的来说,该病到目前为止尚无有效的预防和治愈方法,其中只有基因治疗刚刚取得了突破性的重大进展[5-7]。

一,反相基因治疗初现曙光

由于反相严重危害人类视觉健康,到目前为止还是一个“不治之症“。从十九世纪开始,众多的国内外研究者一直辛勤耕耘在反相研究领域,但是直到最近十年来才取得了一系列重要进展,为反相从“不治之症“逐渐过渡到“可治之症“奠定了坚实的基础。勒温 等1998年 年利用重组腺相关病毒(腺) 介导核酶注射到视网膜下腔,使患有脂肪分化相关蛋白的P23H 转基因鼠感光细胞形态和电生理恢复正常达3 个月之久[8]。2001年年,美国科学家发现一种先天失明狗是由同种RPE65基因基因突变所造成,与人类生命周期评价Ⅱ型非常相似。当把正常狗RPE65基因基因通过腺相关病毒载体导入相关视网膜细胞后,失明的狗又恢复了视力并持续至今[9]。2006年年,庞等用生命周期评价Ⅱ型的动物模型, 同样具有RPE65基因基因突变的rd12小鼠证明:在视网膜变性发生以前进行基因治疗可以全面恢复rd12小鼠的正常视功能,包括其视行为[10]。2008年年美国和英国的三个研究小组几乎同时宣布了成功为9位生命周期评价Ⅱ型患者施行的基因治疗[5-7]。这是人类第一次不仅是在遗传性视网膜疾病方面进行的基因治疗,同时也是第一次在眼科疾病方面进行的基因治疗,它标志着反相基因治疗真正从实验室走向临床,众多科学家认为这是一个划时代的伟大进展,真正开启了眼科遗传性疾病基因治疗的新时代。生命周期评价Ⅱ型基因治疗的成功犹如一声春雷,掀起了新一轮眼科基因治疗研究的热潮,为今后进行反相等遗传性视网膜疾病的基因治疗开辟了光明前景。

但是我们应该清醒地认识到,虽然遗传性视网膜疾病的基因治疗在雷伯氏先天性黑蒙(生命周期评价Ⅱ型)上取得了巨大成功,但是生命周期的发病率非常低,其发病率约为三万分之一〜81000分之1,在遗传性视网膜变性疾病中大约占5%[11]。据此推算,生命周期在美国大约只有2000年名病人,在我国大约只有2.5万〜30000名病人。而且我们现在能够进行基因治疗的还只是由RPE65基因基因突变引起的生命周期(即生命周期评价Ⅱ型),而生命周期评价Ⅱ型又只占全部生命周期的10-15%左右[12],由此可见,目前真正能够进行基因治疗的生命周期患者在美国只有大约300名左右病人,而在我国也只有大约2500〜3000名病人,这与等待基因治疗的数以千千万万的反相患者相比,存在着何等巨大的差距!可见生命周期评价Ⅱ型患者基因治疗成功的科学意义十分重大,但是其社会价值却十分有限。因此生命周期只能是作为我们治疗遗传性视网膜疾病的一个突破口,我们应该把主要精力投入到其他更常见,危害更大的反相等遗传性视网膜疾病上来。

二,反相基因研究现状

要攻克遗传病,首先要找到相关的致病基因。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。对于基因突变的检测,就二倍体生物来讲,经典的突变检测一般是根据基因的分离规律与显隐性突变出现的规律来设计进行的,传统的人类基因突变检测方法主要是家系分析法。上述方法对于显性突变还较为可靠,而对于隐性突变,有时很难断定有关基因究竟是突变而来还是从祖先传递而来。基因突变的分子水平检测,1985年 以前通过应用南 印迹法,可以筛选出基因的缺失,插入和移码重组等突变形式。对于用该法不能检测的突变,只能应用当时复杂费时,昂贵的脱氧核糖核酸 序列测定分析法。1985年 以后,随着多聚酶链反应(聚合酶链反应,聚合酶链反应)技术的出现,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子检测技术都是建立于聚合酶链反应 技术的基础之上,并且由聚合酶链反应 衍生出的新方法不断出现,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有很大提高。近年来,随着人类基因组研究的深入,基因突变检测的步伐不断加快,在原有技术的基础上又衍生出许多新的检测技术尤其是基因芯片(基因芯片)的出现使突变检测变得规模化和程序化。从八十年代开始,采用上述相关的分子生物学技术,到目前为止,已经发现了192个与遗传性视网膜疾病相关的致病基因,其中144个已经被鉴定(图1,RETNET: www.sph.uth.tmc.edu)。

图1 目前发现的遗传性视网膜疾病基因


更为令人振奋的是,目前ASPERBIOTECH公司推出了专门为眼科设计的高效,快速,灵敏度高和特异性强的第三代基因突变检测技术-等位基因特异性引物延伸芯片(阵列引物延伸芯片,顶点)技术的出现和应用,实现了真正眼科的芯片实验室(芯片上的实验室),可以在小小的芯片上完成反相等遗传性视网膜疾病相关的致病基因研究[13]。国外经过应用顶点技术极大地提高了遗传性视网膜疾病基因突变筛查的进度。到目前为止,利用顶点技术已经鉴定出46个与遗传性视网膜疾病相关的致病基因和2497突变位点,其准确性已经得到公认[14]。

到目前为止,已经明确大多数反相为单基因遗传,但也存在二基因双等位基因和二基因三等位基因遗传方式。近年来随着研究的不断深入,已经检测到56%与脂肪分化相关蛋白相关的致病基因,32.7%与阿富汗农村重建方案相关的致病基因,90%与XLRP相关的致病基因[3],通过连锁分析或候选基因筛选已经确定了20个脂肪分化相关蛋白,26个阿富汗农村重建方案和6个XLRP 基因位点,包括紫红,先令甲,RPGR,RPE65基因等,其中35 个基因已经被克隆。反相的基因异质性(多个突变位点引起同一疾病)和表型异质性(单一基因突变与一个家系或家系间的不同表型相关,同一基因的不同突变可以产生不同的表现型),使得反相 潜在的分子水平致病机理变得更加复杂和难以辨别。虽然每种遗传方式中均发现了一些致病基因,但目前仍存在相当部分未知的反相 致病基因位点。这些基因编码的蛋白各自具有不同的功能,如参与光转换,参与视觉循环或作为感光细胞转录因子,组成光感受器结构等,但也有些基因编码的蛋白功能尚不明确(见表1)。

1。脂肪分化相关蛋白的基因研究概况:目前已经能够检测到20个与脂肪分化相关蛋白相关的致病基因,其中较多见的是:紫红(26.5%),铁路发展策略(9.5%),PRPF31(8.0%),印尼盾(3.5%),PRPF8(3.0%),IMPDH1(2.5%),PRPF3(1.0%),档成分股(1.0%),RPGR(1。%),它们约占脂肪分化相关蛋白的56%,其他导致脂肪分化相关蛋白的相关致病基因还包括CA4,FSCN2,夺标,RP9等,但是它们在脂肪分化相关蛋白 中的突变率尚不清楚[3,4](ASPERBIOTECH:www.asperophthaimics.com; RETNET: www.sph.uth.tmc.edu)。

紫红基因是最早发现的脂肪分化相关蛋白致病基因,同时也是引起脂肪分化相关蛋白患者最常见的致病基因,大约26.5%的脂肪分化相关蛋白患者由紫红基因突变引起[15],但是在亚洲的印度脂肪分化相关蛋白患者中大约只有1%由紫红基因突变引起[16],日本脂肪分化相关蛋白患者中大约只有5.9%由紫红基因突变引起[17],我国脂肪分化相关蛋白患者中大约只有7%由紫红基因突变引起[18]。紫红位于人染色体3q21〜24,含有4个内含子和5个外显子,编码一个由348个氨基酸组成的视蛋白,可与视黄醛结合形成视紫红质。它突变时会产生有害的突变蛋白,干扰正常视紫红质的功能,导致脂肪分化相关蛋白。目前已发现有100 多种该基因的突变位点,其中视紫红质基因的P23H,P347L 突变最常见。

P /铁路发展策略 突变约占脂肪分化相关蛋白 的9.5%[16]。P /铁路发展策略基因为感光细胞特异糖蛋白,可能作为一种粘附分子参与光受体形态形成,发挥稳定外部片段盘状结构的功能。部分P /铁路发展策略 的突变可导致反相 黄斑,视杆-视锥细胞及视网膜营养不良[19]。目前刚发现脂肪分化相关蛋白的TOPORS 基因突变不仅能够引起1%的脂肪分化相关蛋白,同时能够引起脂肪分化相关蛋白患者血管周围的视网膜色素上皮上皮萎缩[20,21]。

2。阿富汗农村重建方案的基因研究概况:目前已经能够检测到26个与阿富汗农村重建方案相关的致病基因,其中较多见的是:先令甲(10.0%), CRB1(6.5%),磷酸二酯酶6A条(6.0%),PDE6B(6.0%),ABCA4(2.9%),CNGA1(2.30%),RPE65基因(2.0%),档成分股(1.0%),它们约占阿富汗农村重建方案的32.7%,其他导致阿富汗农村重建方案的相关致病基因还包括切克尔,CNGB1,MERTK,旅客定座记录,RDH12,RLBP1,凹陷,TULP1,商品研究局,先令3A条等,但是它们在阿富汗农村重建方案中的突变率尚不清楚[3,4](ASPERBIOTECH:www.asperophthaimics.com; RETNET: www.sph.uth.tmc.edu)。

目前认为先令甲基因突变约占阿富汗农村重建方案患者的10%[22],其功能可能参与了细胞间营养物质的运输和人视网膜外层的生理发生。在对中国人3个家庭应用序列分析先令甲研究中发现五个新突变(一个小插入,一个小缺失,一个无义突变和一个错义突变以及一个剪接位点突变),五个突变中,4个位于外显子22-72[23]。

CRB1基因突变约占阿富汗农村重建方案患者的6.5%[4]。其特异性地表达在人视网膜和视网膜色素上皮,其功能可能与视网膜神经细胞的发育,排列和极性定向有关。今年刚发现的余仁生基因是人类最大的基因之一,同时也是到目前为止发现最大的与眼相关的基因,其大小超过2字节,其功能被认为与光感受器结构发生有关[24,25]。

3。XLRP 的基因研究概况:目前已经能够检测到6个与XLRP 相关的致病基因,其中较多见的是:RPGR(74.2%),RP2(15.1%),它们约占XLRP的89.3%,其他导致XLRP 的相关致病基因还包括RP6,RP23,RP24等,但是它们在XLRP中的突变率尚不清楚[3,4](ASPERBIOTECH:www.asperophthaimics.com; RETNET:www.sph.uth.tmc.edu)。

连锁分析表明约74.2%的XLRP 是由RPGR 基因突变引起的[26]。到目前为止RPGR 蛋白在视网膜内外的功能并不清楚。由于绝大部分RPGR基因突变仅仅是在单独家系中发现的,因此很难判断其表现型与基因型之间的相关性。总体来讲,携带RPGR 基因突变患者的临床症状与携带其他反相 致病基因突变的患者相比,视野更小,视网膜电图的振幅降低更严重。在四代XLRP中国人家庭发现了一个RPGR的新g.ORF15 1166德拉 突变是引起XLRP的原因[27]。另外,约15.1%的XLRP由RP2基因突变引起[25],该基因编码一个含350 个氨基酸的蛋白,与人辅助因子荤 有同源性,这可能与微管蛋白折叠过程有关。在日本的五个XLRP 家系中,三个出现ORF15 突变,另外一个出现RP2 突变[28]。奈德哈特等对来自德国,丹麦,爱尔兰和瑞士的141个XLRP家系中发现,在46个家系中发现了RPGR和RP2的突变,其中17个是新的突变,35%突变发生在OFR15,最常见的两个突变发生在3,末端。在RPGR外显子OFR15中,发现8个新的突变和14个已知的突变。所有的突变均导致开放阅读框的断裂[29]。
三,反相基因治疗面临的机遇与挑战

虽然目前我们已经能够检测到56%与脂肪分化相关蛋白相关的致病基因,32.7%与阿富汗农村重建方案相关的致病基因(不包括桑兰西,占所有反相的45%),90%与XLRP相关的致病基因。但是还有一半的基因尚未被发现。更需要指出的是,现有的突变基因资料大部分是从西方人种得来的。虽然目前有限的有关中国遗传病治病基因的研究并没有发现明显的种族差异,我们也会密切关注筛选和彻查的结果。如发现某些中国人特有的致病基因,我们会和阿斯珀公司合作,将突变基因尽快放入现有的基因芯片或单独做成新的芯片,为更多的中国眼科医生及反相患者进行更为简单,经济,高效的致病基因初筛创造条件。

我们可以推测修饰基因发挥着重要作用,特别是在不完全外显的脂肪分化相关蛋白和桑兰西的病例,这些修饰基因可以用于未来的治疗,仍然有待发现,完全搞清楚它们所编码蛋白质的功能可能需要若干年。就是目前发现的一些蛋白质,有的功能已经完全清楚,而有的则知之甚少。

如何确切阐明从基因突变到光感受器的变性并导致功能逐渐丧失又是另一个具有挑战性的问题。动物实验和临床研究表明,光感受器细胞死亡是通过凋亡在整个生命过程中以线性累加的方式进行的,这就意味着光感受器细胞凋亡从发病开始一直伴随到疾病晚期,这就给我们提出了所谓的“治疗窗”,即进行治疗的最佳时机问题。还有更为棘手的光感受器变性的机制是多元的,这对未来治疗方法的选择也将是一个十分严峻的挑战。

毫无疑问,基因治疗是反相等遗传性视网膜疾病最根本的治疗方法。但是进行基因治疗的前提是必须筛查出致病的基因。近年来,随着分子生物学技术和方法的进步,特别是在眼科顶点技术的应用,极大地提高了反相等遗传性视网膜疾病基因突变筛查的进度,到目前为止,已经鉴定出54个与脂肪分化相关蛋白,阿富汗农村重建方案,XLRP以及亚瑟综合征和Bardet Biedl综合征相关的致病基因和1595突变位点,我们应该充分利用这些资源,采用顶点技术筛查我国脂肪分化相关蛋白,阿富汗农村重建方案,XLRP以及亚瑟综合征和Bardet Biedl综合征的基因突变情况,建立反相基因突变数据库和完善的诊断体系,为即将进行的基因治疗临床试验打下坚实的物质基础,最终为遗传性视网膜疾病患者解除痛苦带来福音。

反相的基因治疗是目前世界科学研究的热点和发展趋势。反相的共同特点是严重危害人类视觉健康,是眼科领域真正的“硬骨头“,虽然在诊断和治疗方面都取得了巨大进展,但是离真正要攻克反相还有很远的路要走。特别是作为拥有反相资源的大国,我们不管是在反相的基础研究还是在临床研究方面与国外同行相比都存在着巨大的差距!

总体来讲,目前国内反相的诊断和研究整体水平还不高,主要面临的问题是“小,散,弱”。虽然我国人口众多,家族历史源远流长,有众多反相患者的资源优势,但在该领域取得原创性进展的研究工作并不多。主要原因是:(1)实验室技术条件差和缺乏统一组织实施。高水平的技术力量和实验室条件以及良好的组织实施是开展反相等遗传性视网膜疾病诊断和研究的基础。由于反相基因数量众多,目前除国内个别地区(如温州,广州,天津,北京,上海等)开展了一些零星的反相的相关临床和基础研究外,一般实验室很难针对如此众多的疾病基因进行全面分析。我国现阶段尚不具备普遍开展此类检查的条件,如果需要对此类反相开展常规基因突变检测,有赖于建立全国性的反相基因突变检测中心,其他单位可以通过邮寄血样本进行基因突变分析,协作攻关,使我国在该领域的水平得到提高。(2)专项研究经费投入不足。目前还没有从国家层面拿出专项经费集中研究反相的防治。我们应该联合起来共同争取国家在这方面的投入,建立包括反相在内的遗传性视网膜疾病基因治疗研究实验室。现在个别单位已经有建立反相基因突变检测中心的人力,技术和设备条件,如果能得到政府的支持来开展这方面的工作,就能够加快反相基因治疗方面的进展,将会是一件利国利民的实事。(3)多数医生认为此类疾病罕见,不够重视。事实上,反相虽属遗传病,但并非罕见,累计发病者达数百万。同时,对于先证者进行诊断与治疗的研究,不仅对患者本人具有实际意义,而且对于开展产前诊断和干预,减轻家庭和社会负担,提高人口素质具有更深远的意义。(4)目前反相等遗传性视网膜疾病的防治未纳入到国家的防盲治盲计划中,众多的反相患者没有得到社会应有的关爱。我们应该力争将反相等遗传性视网膜疾病的防治纳入到国家的未来防盲治盲计划中,动员国家各级政府和社会力量,争取在3〜5年启动实施反相等遗传性视网膜疾病的防治工作。

二十一世纪将是基因治疗取得重大突破和广泛应用的时代,由于视觉器官本身具有的独特组织结构优势,因此基因治疗首先将在眼科取得重大突破,眼科的突破点在反相等遗传性视网膜疾病!我国具有56 个族群与众多的隔离族,近交系和大家系,有着丰富的反相家系,是人类基因组多样性研究难得的珍贵资源。有专家预测,2015年以前年基因治疗将成为常规治疗方法之一。只要我们充分利用这一优势资源,提高认识,抓住机遇,开发这一在世界范围内独一无二的资源;相信通过我们全国眼科界同仁的共同努力,按照最乐观的预测,力争在3〜5年内能够进行我国某些基因突变类型的反相基因治疗Ⅰ期临床试验!真正开展临床上反相等遗传性视网膜疾病的基因治疗将从理想逐渐变为现实!
期待能治疗的那一天早日到来!那将是我们所有RP人的重生之日。为所有的RP朋友祈祷!
"我们应该力争将反相等遗传性视网膜疾病的防治纳入到国家的未来防盲治盲计划中,动员国家各级政府和社会力量,争取在3〜5年启动实施反相等遗传性视网膜疾病的防治工作。" 说出了RP人
的心声,真希望得到政府的投入和关注啊。
这篇文章我觉得写得非常好,能够让我们充分的了解自己致病基因研究的情况,大家可以针对自己的突变基因(有待检测)进行对比,等待以后的基因治疗。在此要感谢李文生博士提供这么详细的好文章,RP人不会忘记你的。

我的致病基因是隐性的,现在只发现了26个基因位点,还有很多没有发现,真希望自己就是这26个基因中的一个。
5# 雪山飞狐
感谢李博士!
本帖最后由 寒江雪 于 2010-1-20 14:10 编辑

非常好,非常感谢,很好。
不仅要感谢李博士更要感谢为我们带来这篇好文章的飞狐.辛苦了.
辛苦了,飞狐大哥,希望愿望早点实现。
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