知乎作者：RobertLIAN
之前有患者朋友私信给我，问我为什么不分析jcyte的细胞替代疗法了。其实我不是不分析，由于原定于5月初的ARVO峰会改为线上演讲了，我并不确定jcyte是否会在ARVO的内部论坛发布他们临床试验的结果。如果我到时候看到结果了，我一定会写文章分析。今天这篇文章介绍日本东京的RIKEN综合科研中心视网膜再生实验室（Laboratory for Retinal Regeneration）主导开发的一个疗法，诱导多能干细胞移植疗法（induced Pluripotent Stem Cell，以下简称iPS）。该疗法被认为是遗传眼病（包括RP）领域最接近商用，最经济实惠，且适用患者人群最广的遗传眼病细胞疗法。本篇文章以科普综述的形式，将iPS的开发，临床实验结果分析，利弊以及商业化价值完整陈述给各位。由于是科普性质，和以前一样，我会省略in-text citation和reference，如果有同行朋友想要reference，请私信或留言，我会把列表发给您。
首先来介绍一下iPS的开发和历史。RIKEN科研中心是一个类似科学界耶路撒冷的地方，出过诺贝尔奖，出过各种先进技术，还出了高桥政代教授（Dr. Masayo Takahashi）。说到Takahashi就不得不说山中伸弥教授（Dr. Shinya Yamanaka），一个在发育生物学界无人不知无人不晓的2012年诺贝尔生理学奖获得者，我的偶像。2006年，Yamanaka和Takahashi共同完成了一个人类生物学史上的壮举，筛选出了4个必要的转录因子（Yamanaka factors），这4个转录因子（具有将一个分化后的体细胞（differentiated somatic cell）重编程（reprogramming）为一个多能干细胞（pluripotent stem cell）的能力。多能干细胞大家可以理解为是一种像胚胎干细胞（embryonic stem cell）一样，一个细胞能长成一个完整的成年人的东西，而体细胞则是各位身上的有明确分工的，不具备继续分化的能力的细胞，例如锥细胞和杆细胞（cone/rod photoreceptor）。我之前有写过介绍ReNeuron疗法的文章，里面提到过使用的细胞是人类胚胎眼内的视网膜祖细胞（hRPC），和这个胚胎干细胞，以及多能干细胞不是一个东西。在2006年前，生物学界定义人体细胞的发育是从未分化（undifferentiated）到分化后（differentiated），也就是从胚胎干细胞逐渐像种子发芽长出树枝树冠一样分化成各种体细胞，这些体细胞具有各自的功能，并组成组织和器官。我们成年人的身体里是找不到胚胎干细胞的，一个都没有，如果我找到了那这届诺奖就是我的了。这个时候有人想，一个胚胎干细胞都能长成一个人呢，那长成两只完整的眼睛肯定不在话下啦！然后他就成功碰到了一个难题，也就是他无法从成年人身上获得胚胎干细胞。这个时候Yamanaka和Takahashi踩在我干细胞课教授Jennifer Mitchell的头上，从24个有关重编程的转录因子中成功找出了4个关键转录因子（Sox2，Klf4，cMyc，Oct3/4），能够将一个体细胞变成一个和胚胎干细胞几乎一模一样的多能干细胞（除了刻印不同，也就是克隆羊多利活不久的原因，北京那俩克隆猴就是为了解决这个刻印问题）。Yamanaka给这个多能干细胞取了一个很直观的名字，诱导多能干细胞（iPS）。为什么叫诱导多能干细胞呢？因为是用一个已经完全分化的体细胞，比如一个皮肤上皮细胞（skin epithelium），强行表达这四个转录因子（后来叫Yamanaka factor），让这个皮肤上皮细胞在一段时间后转变为一个多能干细胞，这个过程叫诱导。Takahashi继承Yamanaka的衣钵，进入了RIKEN科研中心，创办了视网膜再生实验室。她的思路是，既然一个iPS理论上能够长成一个人，那长成两只眼睛也不在话下啦！她退而求其次，冷静下来思考，长成两只眼睛太奢侈了，长成一片视网膜总可以吧！她走到实验桌前，进一步实际思考，长成完整的多层视网膜组织太难了啊！我要诱导多少步才行......最后她决定只诱导两层视网膜组织，也就是年龄相关黄斑变性（AMD）和视网膜色素变性（RP）患者急需的感光细胞层和视网膜色素上皮层（RPE），然后移植进视网膜就行了嘛！然后她也成功碰到了一个难题。iPS是有了，师兄Yamanaka给培养了好几盘，那怎么把这些iPS进一步诱导成自己想要的感光细胞和RPE呢？这里就是多个实验室共同努力的成果了，两年后，Takahashi成功的设计了一个多步骤诱导法，通过表达CKI7，抑制ALK4和Rho相关激酶，配合血清（serum），Dkk1，activin的培养环境，将iPS成功诱导成了视网膜祖细胞（RPC）。可能有患者会疑惑，为什么这里的祖细胞是RPC而NeNeuron的祖细胞是hRPC？这两者不会只有一个h的不同吧！其实这个h代表的是human，hRPC是人源视网膜祖细胞，从人身上挖下来的，而RPC是用一个iPS诱导出来的，两者虽说差不多，但也不能说相同（抗原方面）。在这个过程中，Takahashi发展出了另一个疗法开发思路。在做自己的老本行发育生物学研究时，她证实了Wnt/beta-catenin信号机理可以激活Muller神经胶质细胞，使其逆分化（dedifferentiation）成为一个RPC，模拟斑马鱼视网膜再生的机理，开创了一个新的RP细胞替代疗法思路。武汉科技大学姚凯教授的主要研究方向就是这个思路，将这个思路商用化是姚教授的团队正在做的工作，同时也是我个人最中意的思路（姚教授千万别骂我我不是有意的）。回归到Takahashi的iPS思路上，她在成功诱导出RPC后（虽然当时的转化率只有16%），花了两年的时间，成功开发了一个改良的诱导方法，这个方法同时能得到较多量的RPE和感光细胞。在无数次的反复尝试下，Takahashi团队发现抑制Notch信号通路可以使RPE细胞（Retinal Homeobox+）转化为锥细胞杆细胞（Cone/Rod Homeobox+），配合上纤维原细胞生长因子（fibroblast growth factor），Shh（Sonic Hedgehog，没错就是那个索尼克游戏！），taurine和视黄酸，得到了大量的杆细胞。由于RPC默认分化为一种介于杆细胞和锥细胞间的细胞型，以至于其rhodopsin的功能并不是非常全，Takahashi这个方法使获得大量杆细胞成为可能。Takahashi很兴奋，这表明她四年的努力没有白费，iPS疗法思路进入临床前最终阶段。这一期间，流式细胞术（FACS）开始广泛应用，这项技术被用来筛选纯化Rx+和CRx+的感光细胞和RPE。在接下来的时间里，世界各地的实验室利用iPS来制造各种导致RP的基因突变组织模型，以便于更进一步研究自己的疗法。iPS为遗传病研究做出了不朽的贡献。
右边就是Takahashi
整个诱导过程和纯化步骤的图解
懒得翻译figure legend了。。。各位看得懂就看看不懂就猜一下这五颜六色的一锅粥是啥玩意。。。
2012年6月，Takahashi的团队发表了临床前研究的结果，证明了使用RHO基因失活突变的患者的体细胞制作的iPS细胞模型具备诱导分化为视网膜祖细胞RPC，杆细胞和RPE的能力。这次的iPS使用一种叫做Sendai病毒的不具致病性的副流感病毒（parainfluenza virus），以一种无致癌风险的病毒载体不融合进细胞染色体的方式成功在患者皮肤细胞内表达了四个关键转录因子（POU5F1, SOX2, KLF4, c-MYC），巧妙地避免了使用Oct3/4，增加了iPS转化效率。在接下来的逐步诱导，培养中，成功的检测到了杆细胞特有的抗原标记和细胞活动。整个转化过程耗费了60天。这次实验标志着iPS应用于人体临床实验的开始。2014年9月，第一次iPS诱导RPE细胞层移植手术在一个70岁AMD患者身上得以实施，这是一次技术理念和安全性的验证，所以采用的是患者自体皮肤细胞（autologous）进行iPS-RPE制作。2016年10月，Takahashi团队在恒河猴模型中证明了MHC配型后的iPS诱导组织移植入体内不会发生免疫排斥反应。这个结论非常关键，因为这标志着我们可以参照造血干细胞骨髓库的模式，建立一个iPS细胞库，通过采用MHC纯合态的志愿者们捐献的异体体细胞（allogeneic），达到提前制备，快速配型，即刻诊断即刻移植的目的。2017年3月，Takahashi团队申请了日本CiRA's iPS库的使用权限，针对AMD患者开始了新一轮的iPS诱导RPE层移植临床实验，实验对象是一个六十岁的AMD患者。此次实验的目的是证明经MHC配型后的异体iPS诱导RPE层移植对于AMD患者是有疗效且无副作用的。这两次实验使Takahashi团队获得了两个不同的RPE细胞系。所谓RPE细胞系指的是为一名患者治疗后，多余的RPE细胞可以在特定培养环境下永生且无限分裂，具备重复利用的能力。两名患者的临床试验结果会在下面介绍。2019年12月，神户眼科中心（Kobe）宣布开始新一轮iPS临床实验。本次实验的实验对象是RP患者，计划使用CiRA's iPS库中配型的异体iPS细胞逐步诱导分化为含RPE层和感光细胞层的小片三维视网膜组织，并移植入患者眼底。由于实验具体内容保密，无从得知患者年龄，病理和实验周期。但可以得知的是，本次实验，也就是日本iPS应用于眼科再生细胞疗法的领域，这是第三次实验，而且这次不再是先导实验，而是真正的实现Takahashi团队初衷的，检验商用化价值的实验，尽管Takahashi本人已经离开RIKEN。
之前写ReNeuron的hRPC疗法的文章时有介绍过MHC配型的概念，大家可以去了解一下。
东京RIKEN的iPS项目目前总共进行了三次实验，前两次为先导实验（pilot study），第三次正在进行中。两次先导实验分别在2014年和2017年进行，分别进行了两年的跟踪随访，实验对象都是AMD患者。两次先导实验的区别在于，2014年的实验目的为验证自体iPS诱导的RPE层组织移植后的疗效和安全性，而2017年的实验目的是验证异体iPS诱导的RPE层组织移植后的疗效和安全性，第三次则是针对RP患者进行治疗并确认商用化价值。第一次实验的实验对象，年龄77岁，性别女，确诊为息肉状脉络膜血管增生（polypoidal choroid vasculopathy），为AMD的一个亚种。在移植前三个月接受过白内障移除手术，最佳矫正视敏锐度（visual acuity）为0.15（0.01-2.0），接受过13个疗程的抗VEGF治疗（兰尼单抗，ranibizumab），然而疗效不佳，视敏锐度下降到0.09 ，直到被选定为临床试验对象。患者右眼增生的血管组织和部分无效RPE层被手术切除，并在视小凹下植入了1.3*3.0mm的一片iPS-RPE组织。植入的RPE层组织起初边缘呈卷起状，在8周后逐渐变平，手术一年后成功融合入视网膜组织。因手术导致的黄斑水肿在手术后4周自行消失，因此没有使用药物抑制黄斑水肿。手术并无副作用，没有组织排异性。手术一年后，右眼最佳视敏锐度并无显著提升，但保持在0.1 。第二次实验的实验对象为68岁男性，确诊息肉状脉络膜血管增生，手术前进行过十次兰尼单抗注射，手术前最佳视敏锐度为0.15，第二位实验对象并未进行异体iPS-RPE移植手术，由于制作过程中，品控环节检测到了RPE的轻微微卫星不稳定，这个迹象表明，全基因组范围内的基因突变可能大量发生，并高度致癌。第二次先导实验实质上为失败。
A是iPS-RPE组织片移植的位置，B主要关注黄斑厚度，C是移植区域的厚度和面积变化。三个方面均展现出组织融合的迹象
这个是正在培养的移植iPS-RPE组织小片。右边为手术中的照片。
领域内上不止是Takahashi一个团队在进行iPS应用于遗传眼病的疗法开发。西班牙Macarena大学利用EYS基因突变失活患者的周边血细胞（单核）构建iPS细胞系，计划开展诱导感光细胞层实验。进度总体慢于Takahashi团队7年，工序步骤类似。法国ANR正在开发自体iPS诱导RPE/感光细胞的技术，进度总体慢于Takahashi团队10年。美国爱荷华大学儿科的实验室正在开发针对RPGR基因失活突变的RP患者的自体iPS体外CRISPR/Cas9编辑后移植疗法（这个名字我取的，估计没人看得懂）。这个疗法思路虽说也是使用了iPS，但是和Takahashi团队的方法截然不同。这个团队从RPGR突变患者手臂上提取皮肤细胞并诱导iPS，在iPS制作完成后，使用rAAV2病毒载体将Cas9/gRNA编辑组件转染到iPS内并修复RPGR上的突变位点（本次为修复了ORF15上的一个三碱基重复片段的无义突变）。这个疗法思路适用患者对象群小，仅限RPGR突变的RP患者，且具有脱靶风险，2016年发表的文献，至今未进行临床实验。据RP之光爱心联盟微信公众号的消息，温州医科大学附属眼视光医院将联合大连医科大学，上海交通大学，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所开展iPS疗法临床研究。项目首席科学家刘晓玲教授与课题组长金子兵教授在研究会上介绍了iPS诱导RPE层治疗黄斑变性的临床一期的背景与执行方案。该组织总体进度慢于Takahashi团队5年，据我个人推测，工序相同。（自体细胞来源的视网膜干细胞治疗黄斑变性的临床项目即将开启）
最后是利弊分析和估价环节。iPS技术就像是一个树干，Takahashi给遗传眼病疗法开发领域的同行们奠定了一个坚实的基础，后续的树枝就是全世界各个实验室共同创新的成果了。总体来说Takahashi团队的进度是最快的。Takahashi团队的疗法在第二次先导实验时遭遇挫折，一度被认为时CiRA's iPS库中提供的iPS细胞具有缺陷。但严格的品控筛选出了微卫星不稳定，核型异常，基因突变等风险故障。由此我们可以看出，不同于ReNeuron的hRPC疗法，iPS显然存在风险。对于RP患者来说，一个能为患者带来利益的疗法必须具备两个条件，一是低价，二是广谱。据我个人判断，Takahashi团队的iPS疗法契合这两个条件。首先是低价，由于这是世界上第一例应用iPS的细胞疗法，因此并没有合适的定价参照。因此我选择了一篇文献来说明。iPS的制造需要满足世界卫生组织定义的GMP原则（Good Manufacturing Practices），概括来说就是专用设备，品控，人员培训。而这些RIKEN都能做得到（Moradit et al. 2019)。疗法本身也具备构建大规模MHC配型iPS库的能力，而且目前也已经存在。如果非常牵强的参照造血干细胞移植的费用，估价范围在15万-30万人民币范围内。参照UKSCF（英国干细胞基金会）的周边血细胞诱导iPS的成本，估价在5万英镑左右。根据北京心血管研究院和美国内布拉斯加大学林肯分校共同开发的一项低成本iPS流水线生产工艺所需的成本，生产一位患者所需的iPS细胞系需要5万美元的成本以及最高可到80万美元的个性化定制成本（Haishuang Lin et al, 2019）。由于温州医科大学附属眼视光医院进行了技术国产化，我们有理由相信成本能够降低一半。再者是iPS适用患者人群非常广，但由于临床实验数据仅限于高龄AMD患者，并不能有效推测年轻RP患者接受手术后的疗效。就理论来说，Takahashi的iPS疗法适用于病程中晚期的遗传眼病患者。
如果有后续的消息，我会及时补充在文末。估价和利弊分析的论述不可避免地会偏向主观，欢迎各位在评论区讨论，也可私信我。 |
