高青 综述 沈吟 审校
430060 武汉大学人民医院眼科中心
通信作者：沈吟，Email：yinshen@whu.edu.cn
DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2018.01.015
高青, 沈吟. 视网膜色素变性疾病的药物治疗基础研究进展[J]. 中华实验眼科杂志, 2018, 36(1):70-74.
【摘要】 视网膜色素变性（RP）是一种可致盲的遗传性眼病，目前尚无有效的治疗措施。尽管近年来基因治疗、干细胞疗法、光遗传学、视网膜假体等新兴技术蓬勃发展，但短期内这些新技术尚未能广泛地应用于临床，故经典的药物疗法仍占据主要地位。虽然目前RP的致病机制暂未十分明确，但已有研究指出，光感受器细胞凋亡为RP形成的共同终末进程。近年来发现炎性因子的过度激活、活性氧自由基的形成可造成RP的进展，某些神经营养因子、光传导中重要物质的缺乏等也可进一步加重RP。药物治疗依据RP的共同致病途径，作用于RP形成的各个阶段，可广泛普适地应用于各种基因型的RP。本文分别从抗光感受器细胞凋亡、抗炎、抗氧化、营养神经等方面介绍近年来RP药物治疗的基础研究进展。
【关键词】 视网膜色素变性；药物治疗；基础研究
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81470628、81270998）；湖北省卫生计划生育委员会青年人才项目（WJ2015Q014）；武汉市科学技术局晨光计划（2016070204010153）
视网膜色素变性（retinitis pigmmentosa，RP）是一组具有高度遗传异质性的神经退行性疾病，其共同特点为进行性光感受器细胞及色素上皮功能丧失，临床症状可有夜盲、进行性视野缺失，眼科常规检查可见眼底色素沉着、视网膜电流图显著异常或无波型。RP有多种遗传方式，常染色体显性遗传、隐性遗传及性连锁隐性遗传，现已发现的突变基因有88种（https://sph.uth.edu/Retnet/sum-dis.htm）。由于其显著的遗传异质性以及复杂的致病机制，目前尚无权威有效的治疗方法。近年来基因治疗、干细胞、光遗传学、视网膜假体等技术新兴发展以及精准医疗等概念的提出给RP的治疗带来新的突破口[1-2]，但这些技术尚停留在动物实验阶段或暂时处于初期临床试验阶段。药物治疗不针对某一个特定的基因型，而以RP已知的共同致病途径为靶点，适用范围广，可在一定程度延缓RP进程；可在疾病早期或无其他治疗方法适应症时使用；可配合其他新兴技术，在围治疗期或治疗期提供一个保护性的环境；可在其他技术还未广泛应用时改善患者生活质量，给予患者一定的心理安慰。现根据RP共同的病理过程总结RP药物治疗的基础研究进展如下。
RP相关致病基因繁多，本文中涉及到的常见的RP模型有：（1）rd（retinal degeneration）小鼠是一种经典的自然突变的常染色体隐性RP（autosomal recessive retinitis pigmmentosa，ARRP）动物模型，Pde6b基因外显子7的无义突变，导致视杆细胞cGMP（cyclic guanosine monophosphate）磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）β亚基功能异常。rd1小鼠视杆细胞于出生后第4天（postnatal 4，P4）开始变性，rd10相较于rd1视杆细胞变性更慢、更温和，作为RP药物试验工具鼠可更好地模拟人类视网膜变性速度。（2） rds（retinal degeneration slow）小鼠是一种自然突变的常染色体显性RP（autosomal dominant retinitis pigmmentosa，ADRP）模型，Prph2（peripherin2）基因突变，从而影响其编码的一种表达于感光细胞外节膜盘边缘、维持膜盘结构及稳定性的跨膜糖蛋白。外核层从出生后第5周开始缓慢变性，出生后12个月时感光细胞完全丢失。（3）RCS（Royal College of Surgeons）大鼠是一种自然突变的ARRP模型，mertk（-/-）（MER proto-oncogene, tyrosine kinase）基因突变，使视网膜色素上皮（retinal pigmented epithelium，RPE）细胞的一种参与结合脱落膜盘蛋白产物的功能发生改变，P18感光细胞开始丢失，至3个月后完全消失。（4）P23H（Pro-23-His）转基因动物（大鼠、猪）是一种ADRP模型，视紫红质（rhodopsin，rho）基因中第23个密码子CCC突变为CAC使其编码的脯氨酸被组氨酸替代，导致了异常基因产物的合成及感光细胞的死亡。Rho突变是人类ADRP患者最普遍的突变。
1 抗光感受器细胞死亡
一般认为光感受器细胞凋亡是不同遗传类型RP的最终的共同病理状态，近来发现坏死和自噬也涉及其中[3]。RP患者首先为视杆细胞死亡，继而引起视锥细胞死亡，因此早期症状常常表现为夜盲和周围性视野缺失。
1.1牛磺熊去氧胆酸
牛磺熊去氧胆酸（Tauroursodeoxycholic, TUDCA）是熊胆汁提取物的主要成分，可抑制凋亡调节剂BAX（Bcl 2 associated X, apoptosis regulator）与线粒体外膜的结合，稳定线粒体，抑制非膜通透性改变依赖的细胞色素 C的释放及随后的细胞凋亡蛋白酶的激活，发挥强大而广谱的抗凋亡效应[4]，在神经退行性疾病中有广泛的研究应用[5]。已有研究证实了腹腔内注射500 mg/kg TUDCA对几种RP模型鼠视网膜的不同保护作用：（1）P23H大鼠（P21～P120）每周腹腔内注射TUDCA1次，光感受器细胞结构和功能以及光感受器细胞与突触后神经元，如水平细胞和双极细胞的突触连接性得到改善[6]；（2）2种品系的rd1小鼠（P6～P21）每3日腹腔内注射TUDCA 1次，B6.C3-rd1小鼠感光细胞的厚度和视锥细胞功能均得到保护，而C57BL-rd1小鼠只见感光细胞厚度有一定的维持，b波无波型，可能由于后者视网膜变性更迅速、剧烈，即在TUDCA处理前视网膜已发生不可逆的变性[7]；③rd10小鼠（P6-P50）每3日腹腔内注射TUDCA 1次，在P50时可见视锥细胞数量和功能的保留，视杆细胞无功能，但在P30时视杆细胞功能还有轻微保留，可一定程度延缓RP进程。该研究还发现胆红素（胆汁的另一种主要成分）也有同样作用，提示血清胆红素浓度可能与RP进程相关[8]。
1.2雷沙吉兰
雷沙吉兰（rasagiline，N-propargyl-1-(R)-aminoindan）是一个选择性的单胺氧化酶抑制剂来对帕金森综合征等神经系统疾病有显著的作用，通过调节线粒体膜上的微孔形成，调节线粒体膜的通透性，从而抑制线粒体诱导的细胞凋亡[9]。Eigeldinger-Berthou等[10]Prph2/rds小鼠雷沙吉兰灌胃，发现它可通过推迟Caspase-3依赖的细胞凋亡途径，诱导抗凋亡蛋白Bcl-xL的产生，发挥抗凋亡神经保护的作用。该研究还发现雷沙吉兰可以影响自噬的产生，且有一定的抗炎作用。
1.3甲基炔诺酮
视网膜及脉络膜可检测到孕激素核受体mRNA[11]，感光细胞及Müller细胞上存在孕激素膜受体组分[12]，奠定了眼作为孕激素靶器官的基础。人工合成的孕酮甲基炔诺酮（Norgestrel）100 mg/kg给于rd10小鼠皮下注射可减少凋亡反应，显著改善感光细胞数量及功能，且神经保护性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）于注射后3 h开始上调，同时磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-related kinases，ERK）1/2上调[13]。甲基炔诺酮可能是激活感光细胞表面孕激素膜受体复合物1（progesterone receptor membrane components 1，PGRMC1），上调bFGF，激活L型钙通道，Ca2+内流，活化钙依赖cAMP-AC-PKA通路，促细胞生存[14-15]。此外，rd10小鼠P20较P15内源性白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）表达下降，与感光细胞凋亡一致，而甲基炔诺酮可上调rd10小鼠中神经保护细胞因子LIF，且其表达量随外核层厚度的增加而增加[16]。
1.4胰岛素原
在胚胎视网膜中，胰岛素原（proinsulin）可激活PI3K/Akt和ERK促生存通路，刺激促生存因子分泌，与细胞凋亡蛋白酶、组织蛋白酶反应，发挥其抗凋亡作用。也可减少脂质氧化损伤[17-20]。在可表达人胰岛素原（human proinsulin, hPi）的转基因rd10小鼠、肌内注射ERK AAV1-hPi的P23H大鼠、单次玻璃体腔注射可加载胰岛素原的生物可降解的聚乳酸-乙醇酸微球[poly (lactic-co-glycolic) acid microspheres，PLGA-MS]的rd10小鼠等模型中，稳定表达胰岛素原，均发现光感受器细胞丢失减少，延缓了RP的发展进程[21-23]。
1.5 磷酸鞘氨醇
磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）作为光感受器发育的关键调节分子，可促进光感受器增生分化[24]。氧化应激可增加神经酰胺的形成，进而分解为鞘氨醇（sphingosine，Sph），而神经酰胺和Sph皆可触发感光细胞凋亡。抑制Sph合成或促进其磷酸化为S1P可抵抗光感受器细胞凋亡[25]。
2 抗炎
近年来炎症反应，如小胶质细胞的激活以及随后炎性趋化因子的产生在RP病理过程中得到了重视[26-27]。RP患者的房水、玻璃体液中细胞因子和趋化因子的浓度较对照组明显升高[28]。但对于RP各病理阶段炎性因子的种类还有待系统整理，将来可针对RP各阶段共同的炎症因子开发新的靶点药物治疗。
2.1姜黄素
姜黄素（curcumin）是一种多酚类抗炎、抗氧化剂，已经历了广泛的临床前发展，可作为预防、延缓RP的潜在用药[29-30]。P23H转基因猪产前（E80-E112）每日饲喂100 mg/kg（母猪体质量）姜黄素，可显著保留视网膜形态结构、调节rho的异常定位[31]。姜黄素可抗蛋白聚集、促进累积的蛋白转运，减少内质网应激反应：用姜黄素处理P23H大鼠表达突变rho的COS-7细胞发现，异常蛋白聚合物解离、rho水平上调并可转运到外节[32]。但其具体分子机制还有待研究。
2.2糖皮质激素类
尽管小胶质细胞的激活在RP的病理过程中的作用是保护或损伤还存在争议，但抗炎、抗小胶质细胞活化可作为靶点，延缓RP进程。将聚酰胺-胺型树枝状高分子（polyamidoamine，PAMAM）纳米颗粒装载肤轻松醋酸酯（dendrimer-fluocinolone acetonide，D-FA），注射于RCS大鼠玻璃体腔，可连续90 d释放FA。D-FA与单纯FA注射及PBS对照组相比，小胶质细胞的活化显著减少，神经炎性反应降低，视网膜形态存留较好[33]。说明持续稳定的抗炎可有效地推迟RP发展。
3 抗氧化
视杆细胞作为光感受器细胞层中的主要细胞，是氧耗的主要细胞。当视杆细胞开始死亡，外丛状层的视网膜毛细血管进行性萎缩，但脉络膜血管仍可供氧，造成了长期慢性的高氧环境，活性氧簇（reactive oxide species，ROS）大量累积，进一步损伤剩余的视锥细胞等感光细胞。自然界中有许多被证实有抗炎抗氧化作用的天然物质。
3.1叶黄素与玉米黄素
叶黄素（lutein）和玉米黄素（zeaxanthin）是在人眼黄斑部存在的性质相同的立体异构体类胡萝卜素，不可体内合成，只能通过食物摄取。其所含双键可与ROS反应来清除自由基，保护DNA，也可抑制泛素-蛋白酶体系统，预防rho、突触小泡蛋白等功能蛋白的降解，从而保护黄斑和光感受器细胞[34]。此外，叶黄素可以起到滤光的作用，吸收进入视网膜的蓝光，保护感光细胞[35]。
3.2藏红花
藏红花中的有效成分，如藏花醛、藏红花素、藏红酸是有名的抗氧化类胡萝卜素[36]。藏花醛以配体-多核苷酸复合物形式结合并保护DNA和tRNA，发挥其抗氧化作用[37]。P23H大鼠（P21～P120）腹腔内注射400 mg/kg藏花醛可改善视网膜形态及功能、感光细胞突触连接及视网膜毛细血管网情况[38]。
3.3 N-乙酰半胱氨酸
N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）自身作为一种抗氧化剂，也可转化为半胱氨酸，即抗氧化系统的重要组成部分谷胱甘肽的前体。给予rd1母鼠（小鼠P1～P17未断奶时）NAC质量浓度为7 mg/ml的饮用水、rd1小鼠（P18～P30断奶后）NAC质量浓度1 mg/ml、rd10小鼠（P35～P180）NAC质量浓度为1 mg/ml或7 mg/ml的饮用水，或在rd10小鼠（P11～P50）角膜每日4次局部应用质量分数0.1%或1%的NAC，均发现有不同程度的视锥细胞数量和功能的保留，长时程的观察中可见其具有一定的剂量依赖性[39]，且无明显的不良反应，可作为临床试验的潜在选择用药。
4 神经营养因子
神经营养因子是较成熟的神经保护类药物，在神经系统疾病中应用广泛。但由于神经营养因子等相对分子质量较大，难以通过血-视网膜屏障；神经营养因子半衰期短，在缓慢的疾病进展过程中难以维持其效用；神经营养因子眼内注药不宜过于频繁等原因而有一定的用药限制。现已开发出了各种可长程给予神经营养因子的新技术，如纳米颗粒、病毒转导、玻璃体内置入可产生神经营养因子的胶囊细胞等。
4.1神经生长因子
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是最早被发现的神经营养因子。NFG生物活性受trkA NGFR （一种酪氨酸蛋白激酶受体）和p75NTR调节，并由细胞表面两受体表达之比决定[40]。将P10 RCS大鼠离体培养的视网膜细胞用50 ng/ml鼠NGF处理6 d，发现trkA NGFR和视紫红质共标记，Bcl-2表达上调、Bax下调，表明NGF可直接作用于感光细胞，抑制细胞凋亡[41]。一项近期的临床试验研究了短程NGF的神经保护作用，8例RP晚期患者每天1 mg鼠NGF点眼1次，连续10 d，3例患者表示有视功能改善的主观感受，出现的唯一不良反应是短暂的、可耐受的局部角膜刺激[42]。
4.2睫状神经营养因子
睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）是视网膜神经保护研究最多的神经营养因子之一。CNTF可与特异性受体CNTFRα以及一般受体LIFRβ、gp130结合，激活Jak/STAT和MAPK通路。取10周龄Rho-/-小鼠视网膜体外培养，给予不同剂量（50～200 ng/ml）CNTF处理后，发现视锥细胞明显存活，且呈剂量依赖性[43]。Kauper等[44]利用胶囊细胞技术，在RP患者眼内睫状缘区置入1个名为NT-501的胶囊，该胶囊细胞可持续分泌CNTF 2年，耐受性较好，且未引起免疫反应和不良反应。Birch等[45]同样在RP患者中应用胶囊细胞技术，随访1年发现实验组和对照组在一些关键参数上，如视敏度、视野敏感性等，并无明显差别。故还需摸索不同剂量CNTF的疗效，并进行长时间大样本的随访。
4.3视杆源性视锥细胞生存因子
视杆源性视锥细胞生存因子（rod-derived cone viability factor，RdCVF）是由视杆细胞分泌的蛋白，可延缓视锥细胞的变性。在6个月龄P23H大鼠中每月注射3 μl 0.5 μg/μl RdCVF，每月1次，连续注射3个月，可有效挽救视锥细胞数量和功能[46]。RdCVF可激动Basigin-1（BSG1，一种在光感受器细胞表面特异性表达的跨膜蛋白）受体，刺激BSG1与葡萄糖转运蛋白（glucose transporter 1，GLUT1）反应，使进入视锥细胞的葡萄糖增加，从而刺激有氧糖酵解促进视锥细胞存活[47]。但目前有研究指出由于血-眼屏障的存在，蛋白质眼部给药非常受限，因此持续的RdCVF可能需要借助眼内腺相关病毒基因疗法载入该基因发挥作用[48]。
4.4脑源性神经营养因子
研究发现，运动可增加20％内源性视网膜脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的水平，而全身注射BDNF原肌球蛋白受体激酶（tropomyosin-receptor-kinase，TrkB）受体拮抗剂可降低视网膜功能和感光细胞核计数，表明有氧运动可起到视网膜变性的神经保护作用[49]。BDNF可通过结合TrkB受体激活MAPKs、PI3-K/Akt通路，也可调节ERK 1/2磷酸化，产生c-jun和硫氧还蛋白，从而抵抗3硝基丙酸的毒性作用[50]。对2周龄或3周龄rd小鼠玻璃体腔内注射25 μg/L或50 μg/L外源性BDNF，可见视网膜超微结构的形态改善，c-jun蛋白在视网膜中的表达呈现BDNF剂量和时间依耐性[51]。
5 维生素A和DHA
维生素A是形成视紫红质和视觉转导的重要物质。DHA是感光细胞膜的重要组成部分，对维持感光细胞的形态功能意义重大，作为保健品已广泛应用于眼科、神经、母婴等领域，但其对于RP的疗效仍存在争议。一项随访4年的随机对照双盲试验表明，12 mg/d叶黄素联合服用维生素A可减缓不吸烟RP***的视野丧失[52]。给予X连锁RP患者每日30 mg/kg DHA，随访4年，未见明显不良反应，但疗效与对照组相比亦无明显变化[53]。
目前的RP治疗方法有药物治疗、干细胞疗法、基因疗法、光遗传学疗法、视网膜移植、视网膜假体、中医针灸等。在后几种方还未广泛应用于临床之前，药物治疗显得举足轻重。随着材料科学的研发与创新、多学科的融合，各种新型眼内给药技术也层出不穷，如纳米微粒、脂质体、胶囊细胞等植入性眼内缓释给药系统，可持续分泌特定药物，可在眼内维持稳定浓度及疗效且不用反复注射。同时基因检测技术等科学技术也在发展，RP的致病机制也将逐渐揭开与完善，届时可针对其分子途径，制定更精准的、疗效更好的靶向药物治疗。
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