眼部疾病的基因治疗进展

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作者：吕菊玲。2016年10月。
中华实验眼科杂志, 2016,34(10): 952-956. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.019。
摘要
目前，全世界已有31项眼部疾病基因治疗临床试验被批准，多数仍处于研究阶段。Leber先天性黑朦(LCA)目前已开展Ⅲ期临床试验，随访时间最长6年；无脉络膜症多中心的临床试验也取得了积极效果；视网膜色素变性(RP)已开展基因治疗Ⅰ期临床试验；年龄相关性黄斑变性(AMD)基因治疗的Ⅰ期临床试验结果令人鼓舞；青光眼基因治疗中使用RNA干扰技术和优化的偶联表面活性磷脂纳米微粒也取得了良好效果。就LCA、RP、无脉络膜症、AMD和青光眼基因治疗的一些实验室及临床研究进展，包括眼部基因治疗方法、各种基因载体和常用的动物模型等进行综述。病毒载体已广泛应用于眼部疾病的基因治疗中，一些与免疫排斥和基因突变相关的潜在性风险以及个体反应的差异性促使人们去探索更安全、高效的方法。基因编辑技术的出现，必将对眼部疾病的基因治疗领域产生深远影响。
  引用本文: 吕菊玲, 邢怡桥, 沈吟. 眼部疾病的基因治疗进展 [J]. 中华实验眼科杂志,2016,34( 10 ): 952-956. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.019 正文作者信息基金 3 关键词 5 主题词 0English Abstract评论阅读 36 引用 0相关资源视频 0 论文 0 大综述 0以下内容和版式版权归属中华医学会，未经授权不得转载 × 基因治疗指利用DNA重组技术将目的基因转染至靶细胞内，包括基因改建、修饰和置换，干预异常基因表达，纠正遗传病的基因缺陷而达到治疗疾病的目的。眼部视网膜变性疾病已成为当今世界上不可逆盲的主要原因，其视功能损害的病理基础是视网膜神经元的不可逆性损伤，如视网膜色素变性(retinitis pigmmentosa，RP)、Leber先天性黑朦(Leber congenital amaurosis，LCA)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)及青光眼等，目前临床上仍缺少有效的治疗手段。随着分子生物学水平、基因诊断和治疗水平的提高以及基因测序技术的广泛应用，人类对疾病本质的认识更加深刻。就LCA、RP、无脉络膜症和AMD、青光眼基因治疗的一些实验室及临床研究进展进行综述。

1　眼部疾病基因治疗的优势
眼球特殊的生理及解剖学特点使之成为基因治疗的理想器官。(1)眼部遗传病多为单基因病，治疗相对简单。(2)眼球是一相对独立的器官，体积较小，所需基因或细胞的数量相对较少。(3)眼球属于相对免疫赦免器官，由视网膜血管和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)共同组成血－视网膜屏障，外来药物、基因和细胞较少引起免疫应答。(4)可以实现双眼间的自身对照。(5)眼的屈光透明性使得我们能够在可视情况下进行眼部操作。(6)可借助裂隙灯显微镜、眼部超声检查仪、眼底照相仪、OCT等直接观察眼部各组织的结构，也可应用视觉电生理、荧光素眼底血管造影等评价视网膜神经细胞和视功能改变。

2　眼部疾病基因治疗的方法
2.1　常规给药
常规给药方法包括局部点药、球周注射、前房注射、玻璃体腔注射、视网膜下注射和脉络膜上腔注射给药，每种给药方式各有利弊。由于解剖位置的不同，视网膜下注射给药主要转染RPE细胞和光感受器细胞；玻璃体腔注射主要转染视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)。球周给药包括球侧注射、球后注射、后巩膜下注射、球筋膜囊下注射和结膜下注射。球结膜下注射适于给药量较大的药物，可重复性好。

2.2　基因导入系统
理想的基因导入系统是通过非侵入或低侵入性方法给药，靶组织能够有效、广泛地吸收，且无异常基因表达。基因导入系统主要包括以下几种导入方式：(1)病毒载体　病毒载体在基因导入系统中最常用，主要包括腺病毒、腺相关病毒载体(adeno-associated viruses，AAVs)、慢病毒载体和逆转录病毒载体。AAVs转染效率依赖于血清型和衣壳蛋白。衣壳蛋白可以在不同的血清型之间交换形成AAVs重组体。AAV2/5和AAV2/8转染光感受器细胞效率最高，以视杆细胞为主。AAVs转染效率在不同种属和不同组织中各不相同，在活体和离体组织中也不尽相同，如在角膜纤维细胞中，AAV6的转染效率是AAV2/8和AAV2/9的30～50倍[2]；在活体小鼠角膜和离体人角膜的转染效率AAV2/9>AAV2/8>AAV2/6[3]。病毒载体能够瞬时或长期稳定高表达外源基因，通过抗性筛选建立稳定表达的细胞系，但同时也存在一定的免疫原性和靶细胞毒性，不能通过人体代谢；(2)RNA干扰技术　如小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNAs)缓释系统可以提高基因导入效率、减少注射次数；(3)非病毒载体　非病毒载体分为物理方法和化学方法。物理方法主要包括离子导入法、电穿孔转染、基因枪法和细胞核转染，该方法转染效率有限；化学方法主要包括脂质类载体和聚合物载体。相较于病毒载体，非病毒载体毒性较低且代谢性较好，可针对病变部位进行个体化转染[4]。

2.3　基因表达元件
基因表达元件包括：(1)组织特异性启动子　如胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的靶细胞是视网膜Müller细胞[5]；(2)可诱导性调控序列　包括环境诱导系统和药物诱导系统，即启动子对特异性环境信号或药物作出反应，如糖尿病视网膜病变和AMD患者在正常氧含量条件下低氧反应元件不起作用，需设计某种载体诱导低氧区域基因表达来对抗视网膜新生血管[5,6]；利用多西环素可诱导表达系统治疗视网膜新生血管、糖皮质激素反应元件治疗青光眼[7,8]。

3　眼部疾病基因治疗的现状
眼部疾病的基因治疗还处于起始阶段，还需很长一段时间的过渡期实现从动物实验到人体临床试验。目前，眼部疾病的基因治疗已经在RP、LCA、AMD和青光眼等遗传性疾病研究中取得了一些进展。

3.1　眼部罕见疾病的基因治疗
3.1.1　LCA
LCA的基础与临床治疗效果显著，是现今眼科基因治疗的典范。到目前为止，已经发现了14个与LCA相关的致病基因，其中RPE65基因在RPE细胞中特异性表达，其编码的蛋白质参与光信号物质的代谢循环[9]。自2008年以来，在LCA患者中实行基因治疗的临床试验相继开展，部分患者视功能明显改善。Boye等[10]在LCA1小鼠模型上利用AAV载体进行相关基因治疗，结果显示模型鼠视网膜功能恢复且维持6个月以上。

Burnight等[11]利用慢病毒载体将CEP290导入LCA患者体外培养的CEP290突变细胞中，可改善患者细胞纤毛形成缺陷。Bainbridge等[12]对接受临床试验Ⅰ～Ⅱ期(3年)rAAV2/2基因治疗的12例LCA患者进行研究发现，患者视敏度明显提高且程度不一，其中6例视敏度峰值出现在基因治疗后6～12个月，随后开始下降；3例出现眼内炎；2例视力减退明显；所有患者中心视网膜厚度变薄；同时研究犬载体剂量与视功能、视网膜电图(electroretinogram，ERG)的关系，发现低载体剂量只能改善视觉引导的相关行为，而高载体剂量引起的视功能改善可以通过ERG检测发现。这些结果表明，rAAV2/2 RPE65可以暂时性地改善视敏度，但载体剂量存在种属差异。Jacobson等[13]进行的LCA临床试验随访5～6年结果显示，3例患者治疗后6个月时视敏度均提高，视力改善最长能够维持3年，其中1例患者治疗后1～3年视敏度明显增加，之后开始下降，但视网膜光感受器细胞数量丢失率同治疗前，说明基因治疗后早期视力改善和后期减退均存在快相期和慢相期，与同时伴有光感受器细胞变性有关。

3.1.2　无脉络膜症
无脉络膜症是性染色体连锁隐性遗传性眼病，发病率为1/50 000，多为男性，主要由于编码REP1的CHM基因突变导致。该病主要病理特征为脉络膜、RPE层和光感受器细胞的进行性萎缩[14]。MacLaren等[15]对6例无脉络膜患者黄斑下注射AAV.REP1来评估基因治疗的疗效，结果显示所有患者治疗后视力与治疗前相比均有提高，暗适应微视野均有改善，治疗6个月后的黄斑视敏度与所治疗区的载体剂量有关。该项临床试验说明，基因治疗后视杆细胞和视锥细胞功能恢复，克服了视网膜脱离所产生的负作用，为进一步研究视网膜疾病基因治疗的临床应用提供了证据支持。

3.1.3　RP
全世界RP的发病率为1/4 000，中国RP的发病率高达1/1 000[15,16]，其相关致病基因繁多。目前，RP已开展基因治疗Ⅰ期临床试验，3例患者接受了视网膜下注射携带特异RPE启动子的AAV2，无不良反应发生[17]。Choi等[18]在Rlbp1－/－小鼠视网膜下注射scAAV8-pRLBP1-hRLBP1(包含AAV8的衣壳和自身互补基因组)能提高该小鼠的暗适应率。Guo等[19]将HDAC4通过质粒转染rd1小鼠视网膜，发现光感受器细胞存活时间延长。RP的产生机制包括细胞自主机制(即光感受器表达基因的突变)和非细胞自主机制(即炎症的影响)。Zhao等[20]通过基因敲除的方法消除小胶质细胞后，视杆细胞变性得到改善。

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3.2　眼部常见疾病的基因治疗
3.2.1　AMD
AMD是发达国家50岁以上人群不可逆盲的主要原因。目前美国有900万AMD患者，预计到2050年会达到1 780万[21]。中国的AMD患者也有逐年增加的趋势。根据组织病理学特点可将AMD分为：早期、中期和晚期AMD[22]。Rakoczy等[23]检测了8例湿性AMD患者单次视网膜下注射rAAV.sFLT-1基因治疗的疗效，并随访1年，证实了其安全性和耐受性较好，单次基因治疗可以达到长期抗新生血管形成的作用。一项多中心Ⅰ期临床试验对27例晚期AMD患者行单次玻璃体腔注射50～3 000 μg PF-04523655(小分子干扰RNA，可抑制低氧诱导基因RTP801)，随访2年，未发现明显的毒性作用和不良反应，患者耐受性好[24]。

3.2.2　青光眼
截止到2010年，世界范围内因青光眼致盲的患者达6 000万余，预计到2020年青光眼盲的患者达到近8 000万[25]。40岁以上***每40人中就有1人因青光眼造成视力丧失。目前，控制眼压仍是青光眼治疗的主要目标，而青光眼致盲的主要原因是RGCs的损伤。青光眼相关易感基因位点PLEKHA7、COL11A1、rs1015213的发现促进了青光眼的基因治疗[26]。这些基因主要影响房水分泌和引流系统，包括小梁网、虹膜、睫状体来调控青光眼的发生和发展。通过转基因的方法补给外源性神经营养因子、凋亡抑制剂和存活因子或其重组蛋白对阻止和减少进展期青光眼RGCs的凋亡具有重要意义。Liu等[27]通过导入细胞凋亡蛋白抑制剂或抗凋亡基因Bcl-2编码基因来抑制RGCs凋亡级联反应，Thumann[28]利用RNA干扰技术抑制促凋亡因子的表达。Alqawlaq等[29]设计了优化的偶联表面活性磷脂纳米微粒，大小为150～180 nm，这种非病毒载体可成功地将治疗基因导入青光眼模型的相关靶组织内。

SYL040012是一种双链寡核苷酸，能够通过RNA干扰技术特异性地抑制β2肾上腺素受体的合成，从而达到降低眼压的目的。Moreno-Montañés等[30]将SYL040012应用于健康人群临床试验中，耐受性良好，全身和局部未见明显不良反应，24例受试者给药(不论剂量高低)后7 d，15例眼压显著降低。

4　眼部遗传病的常用动物模型
基因治疗中建立动物模型非常重要。眼科疾病中经典的动物模型主要包括LCA、无脉络膜症、RP、AMD和青光眼，其中，LCA和RP具有共用的动物模型。

4.1　LCA
Rpe65－/－、rd12、Lrat－/－小鼠和RPGRIP1－/－犬模型是LCA常用的动物模型。RP GTP酶调节因子结合蛋白1(RP GTPase regulator interacting protein 1，RPGRIP1)基因敲除后小鼠的视杆细胞和视锥细胞变性进展迅速，出生后20 d即有大量散布的光感受器细胞感光色素，残留光感受器外段短小且杂乱[31]。Pawlyk等[32]利用AAV8载体对人RPGRIP1基因突变的LCA6患者进行基因治疗后，发现视网膜功能丧失得到延缓。Zhang等[33]利用基因删除的办法将Lrat－/－小鼠的LCA模型视锥蛋白去除后，发现能有效阻止视网膜视锥细胞变性。

4.2　无脉络膜症
目前，尚未见到人类无脉络膜症患者其他组织和器官受影响的报道。斑马鱼CHM基因敲除后，由于其本身缺乏REP2(REP1相似蛋白)，受精后4 d视网膜正常发育，随之即表现出严重的多系统症状，出生后6 d即死亡[34]。CHM基因敲除的雄性小鼠模型(Chmnull/Y)胚胎异常而容易死亡，而CHM基因敲除的雌性小鼠模型(Chmnull/＋)成活率较高且能够生育，且存在进行性视网膜变性的表现，成为无脉络膜症较理想的模型[35,36]。

4.3　RP
RP有多种动物模型，常用模型主要包括自然动物模型和基因动物模型。

4.3.1　自然动物模型
(1)RCS大鼠RP动物模型　该模型大鼠RPE细胞存在一种基因表达，而不能吞噬光感受器细胞脱落的盘膜[37]，光感受器细胞数目于出生后18 d开始减少，直至出生后3个月完全消失。(2)rd1小鼠　由于Pde6b基因发生无义突变，引起磷酸二酯酶β亚基功能异常，该模型小鼠出生4 d时视杆细胞开始变性，出生后4周时完全消失；(3)rds小鼠　rds小鼠是peripherin/rds基因发生突变，影响了该基因编码蛋白的表达[38]，主要影响外层视网膜，光感受器细胞外节发育不良，出生后2周时外核层、外丛状层开始变薄，到出生后12个月时视网膜光感受器细胞消失[39]。

4.3.2　基因动物模型
(1)RPE-65基因敲除小鼠　该模型中视网膜上皮细胞功能被破坏，造成全反式视黄醇的过多堆积和11-顺式视黄醇乙酸脂不足[40]。(2)视紫红质(Rhodopson)基因敲除小鼠　视紫红质基因突变是人类常染色体显性RP中最常见的致病原因，可用于评价基因治疗效果。(3)甲基亚硝基脲(N-Nitroso-N-methylure，MNU)诱导RP小鼠模型　MNU诱导RP小鼠模型是多种程序共同参与的选择性诱导光感受器细胞凋亡[41]。Kim等[42]在成年小鼠60 mg/kg腹腔注射MNU后5～7 d，外层视网膜损伤明显，成功构建了RP小鼠模型。

4.4　AMD
4.4.1　干性AMD
(1)Elovl4 5-bp基因敲除AMD模型　E_mut＋/－鼠表现为RPE层空泡状变化，得到ELOVL4的延伸变性，从而引起Stargardt病动物模型[43]。(2)Sorsby眼底退化病(Sorsby fundus dystrophy，SFD)　SFD与TIMPS基因突变有关，是罕见的迟发性视网膜和脉络膜变性遗传病，Timp3－/－鼠是该模型的成功代表[44]。

4.4.2　湿性AMD
(1)激光诱导模型　Askou等[45]使用绿色氩激光诱导小鼠脉络膜新生血管形成，Bruch膜断裂时光凝部位会出现气泡，有利于脉络膜新生血管的形成。激光造模的优点是造模迅速，但存在一定的自限性。(2)眼内注射模型　Baffi等[46]利用表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的腺病毒载体构建脉络膜新生血管模型。可溶性VEGF受体1(sFlt-1)是视网膜光感受器和角膜无血管特性的重要保护因子，视网膜下注射携带sFlt-1 shRNA的腺病毒载体后，可诱发脉络膜新生血管形成[47]。

4.5　青光眼
4.5.1　玻璃体腔注射兴奋性氨基酸
玻璃体腔注射兴奋性神经毒谷氨酸或N-甲基-D-天冬氨酸可引起RGCs内Ca2＋超载从而导致细胞死亡[48]。许多神经保护药物的细胞及分子机制利用该动物模型进行研究。

4.5.2　巩膜表面静脉注射高渗盐水
巩膜表面静脉注射高渗盐水是较理想的慢性青光眼模型，病理生理过程类似于人类的开角型青光眼，原理是将高渗盐水注射进巩膜表面静脉致小梁网坏死，影响房水外流使眼压升高。眼压升高程度与RGCs死亡率呈正比[49]。

5　展望
目前，全球已有31项眼部疾病基因治疗临床试验被批准(http：//www.abedia.com/wiley/)，其中部分已经完成。病毒载体是目前眼部疾病最常用的基因导入系统。31项临床试验中有21项使用病毒作为载体(16项临床试验中使用AAVs载体，4项使用慢病毒载体，1项使用逆转录病毒载体)，5项利用siRNA基因沉默技术，基因替代治疗在临床治疗中应用广泛。眼部疾病的基因治疗取得了一些令人鼓舞的成果，但也存在与免疫排斥和基因突变相关的潜在风险，并且多种基因与药物有效性的研究也发现，物种之间的药物有效性存在差异。

随着生物技术的不断变革，从第1代人工核酸酶介导的锌指蛋白核酸酶技术，到第2代转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)技术，以及当前最新的RNA引导的成簇规律间隔短回文重复相关核酸酶(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat CRISPR-associated nuclease，CRISPR-Cas)技术，即"基因剪刀"技术，各种强有力的基因编辑技术不断涌现，其中CRISPR-Cas9系统成为生命科学领域的最热门研究。CRISPR-Cas9系统利用一段序列特异性RNA分子作为导向，完成对细胞DNA快速、高效和精确的靶向修饰，且可同时应用于多靶点切割。Wu等[50]已将CRISPR-Cas9系统应用于白内障小鼠模型的基因治疗中，取得较好的效果。基因编辑技术已广泛应用于各类物种的遗传学改造、构建转基因动物模型和基因治疗领域，与中国"精准医疗"战略高度一致，加快了人类对疾病基因组层面的认识，进一步探索如何将顶尖的技术和方法延伸应用于临床必将对眼部疾病的基因治疗领域产生深远影响。