视网膜色素变性患者复明的希望
尹卫靖王丽娅王薇潘峰
·专家述评·
【摘要】视网膜色素变性(RP)是一种遗传性视网膜疾病，其典型的临床表现为早期视杆细胞的退行性
病变以及视锥细胞胞体相对长期的存活。目前实验研究证实，通过腺相关病毒载体和慢病毒载体将微生物型
的光敏感通道蛋白Channelrhodopsin-2或halorhodopsins导人RP模型鼠的视锥细胞胞体或其他细胞，可以使
这些细胞获得光反应并激活视网膜传导通路，向视觉中枢传递视觉信息。因此，这为RP患者的复明带来了
希望。
【关键词】视网膜色素变性；基因疗法；视杆细胞；视锥细胞；腺病毒载体；慢病毒载体；光敏感通
道蛋白
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)等疾病
可以导致部分或全部视觉功能的丧失…。RP是一种
遗传性视网膜疾病，迄今研究已经证实，大约有44个
基因的变异与RP患者的视杆细胞功能损害相关，并
能最终引起视杆细胞的退行性病变口1。因此，RP患者
早期典型的临床表现为暗视觉的逐渐缺失，然后，随着
主导明视觉和色视觉的视锥细胞外节膜盘结构的逐渐
丢失，最终引起全部视觉的损害。据统计，在美国每年
有50 000～100 000人患此种疾病¨J。临床研究和实
验研究均表明，视细胞的退行性病变是导致RP患者
DOI：10．3760／ema．j．issn．20954)160．201 I．02．001
作者单位：450003郑州，河南省眼科研究所(尹卫靖、王丽娅)；
100083北京大学第三医院眼科北京大学眼科中心(王薇)；10016美
国纽约大学眼科、神经科学和生理系(潘峰)
通信作者：潘峰，Email：Feng．Pall2@nyume．org
视力严重损害的病理学基础”。。
近二十年来，随着医学分子生物学和眼科病理学
研究的进展，对RP进行干预以保留或恢复患者视觉
功能的研究已取得较大进展，其方法大致可以分为两
类：(1)细胞移植：即通过将正常视细胞、视网膜色素
上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞或胚胎干细
胞移植到病变的视网膜中[5-6]，以期恢复视网膜的正
常解剖结构，从而达到恢复患者视力的目的。(2)视
网膜假体植入：通过利用电子芯片等电刺激装置植入
患者视网膜组织，产生模拟视觉的效果"’81。这些治
疗方法虽然在一定程度上取得了一些进展，但是一些
根本问题仍然未得到解决。在细胞移植方面，例如胚
胎干细胞移植后如何调控移植的干细胞的分化过程和
方向；如何控制移植的神经细胞间突触连接以及信号
传递等问题∽]。而至于电子植入物方面则面临更多
万方数据
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的挑战，例如电子植入物的制作涉及更多的生物工程
领域的复杂过程，尤其是制作技术的可行性等；此外，
电子植入物与受体组织的长期生物相容性等问题都尚
未得到妥善解决¨o，这些问题是目前制约上述研究进
展不可逾越的障碍。
近来，基因疗法，尤其是光敏感通道的研究有了令
人欣喜的进展。科学家直接将RP动物模型视网膜内
残存的视细胞、双极细胞或其他神经细胞从基因水平
进行改造，并将其导入光敏感通道，使这些细胞具有类
似视细胞的感光功能¨0。…。实验研究表明，将微生物
型的光敏感通道蛋白channelrhodopsin-2或halorhodopsins
基因通过合适的载体转导进入光敏感通道的疗法不仅
成功地挽救了RP动物模型的残存视功能，而且也避
免了异体组织或电子芯片植入所带来固有的、难以克
服的缺点以及组织的免疫排异反应。
1 Rhodopsins的结构和特性
在视杆细胞的膜盘内，Rhodopsins是光敏感分子，
Rhodopsins能将光能转化为化学能或相应的视觉电信
号。Rhodopsins广泛存在于微生物、无脊椎动物和脊
椎动物眼中。目前，巳知Rhodopsins的相对分子质量
约为40 000，具有完整的膜蛋白，其中包括7个跨膜螺
旋体。Rhodopsins作为一种结合蛋白，由视蛋白
(opsin)与视黄醛(11．cis-retinal)通过希夫碱(schiffbase)
连接而组成，这种连接方式使得视黄醛对约
500 nm波长的可见光具有最大的吸收率和最有效的作
用范围。在光照条件下，11．顺视黄醛(11-cisretinal)的
构象结构发生转变，进而使Rhodopsins活化，具有活性
结构的Rhodopsins通过一系列G．蛋白反应并通过
cGMP依赖的离子通道来调控各种离子的进出，从而
达到传递相应视觉信号的目的¨2。1 31。
微生物型的Rhodopsins 014]是以全反式视黄醇(all—
trans retinal)作为初始的活性状态，其特点是在构象发
生改变后可以在原位恢复其活性状态；此外，作为初始
状态的活性微生物型的Rhodopsins直接与离子进出细
胞膜的通道连接在一起；微生物型Rhodopsins的这些
特性，使之成为最合适的类似人视网膜Rhodopsins的
转基因个体。微生物型的Rhodopsins存在于古细菌、
原核生物和真核生物中，20世纪70年代，科学家首次
从嗜盐古菌(haloarchaea)中发现微生物型Rhodopsins
的光敏感离子通道。近来，2种微生物型的Rhodopsins
即光敏感通道蛋白已被成功克隆，它们是
channelopsin-1(Chopl)和ehannelopsin-2(Chop2)，其
中Chop2更具有生物学活性‘15]。
2光敏感通道蛋白的生理功能
光敏感通道蛋白-2(ehannelrhodopsin-2，ChR2)是
从绿衣藻(green alga Chlamydomonas reinhardtii)中提
取，是Chop2和色素蛋白(chromophore)的复合体，是
一种微生物型的Rhodopsins[16]。在光照条件下，ChR2
可以调节钠、钾、钙离子进出细胞膜。ChR2在蓝光照
射时，可以使视细胞去极化，其最适宜的刺激波长约为
460 nm，其激活时间可以精确控制到毫秒。与ChR2
功能相对应的另一种光敏感通道蛋白是halorhodopsins
(HR)¨“，HR从两种古细菌Halobacterium salinarum
(HsHR)和Natronomonas pharaonis(NpHR)中所提取。
激活HsHR和NpHR后可以进一步激活细胞的氯离子
泵，使细胞膜发生超极化反应，其最大的光刺激波长大
约580 am。由于ChR2和HsHR／NpHR的光刺激波长
不同，可以使细胞分别发生去极化或复极化反应，从而
实现通过不同波长的光来调控细胞电生理活动的效
果。ChR2和HsHR／NpHR无细胞毒性，它们在细胞
膜内外均可以表达¨引。科学研究人员将NpHR进行改
造，称之为enhanced Natronomonas pharaonis halorhodopsin
(eNpHR)，可以在包括人类在内的哺乳动物细胞内更
为高效、安全地表达，并且在体内外无自身的增生抑制
作用‘191。
3基因转载载体的选择
基因疗法的关键步骤是将目的基因经载体转导入
靶细胞，因此选择高效、无毒的载体是基因治疗的重要
环节。腺相关病毒(adeno-associated viruses，AAVs)被
认为是具有上述优点的一种腺病毒载体Ⅲ屯¨。它可
以将ChR2和HsHR／NpHR载入不同的视网膜细胞
内，并使之与宿主基因整合，从而使植入的基因能稳
定、长期地表达。这种病毒载体可以直接注入玻璃体
腔，3—4周后视网膜细胞内可见ChR2和HsHR／
NpHR的表达。此外，关于AAVs注入玻璃体腔后的
远期观察表明，AAVs对视网膜无不良反应¨…。此外，
慢病毒载体(Lentiviral vector)也可以作为一种高效的
基因载体，使eNpHR在视网膜内获得高效的表达心2。。
4 ChR2导入正常小鼠视网膜的生理学研究
Bi等¨刮将ChR2通过AAVs导入生后l d正常鼠
的视网膜，发现3—4周后视网膜水平细胞、无长突细
胞、双极细胞、神经节细胞(包括ON和OFF神经节细
胞)中均可见荧光标记的ChR2的表达。为进一步了
解表达ChR2的细胞是否像正常视杆细胞一样具有正
万方数据
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常的光反应功能，作者用全细胞膜片钳技术记录单个
细胞的电活动，从而避免视细胞的光反应向下级神经
元传导的干扰，结果证实表达ChR2的细胞有光反应
电位。能引起大部分细胞光反应的光波特性为：光强
度约为2．2xlO”光量子／(cm2·s)、波长分布于460 am周
围；部分激发细胞反应的光强度为2×10”光量子／
(cm2·s)。总体上，能引起细胞反应的光照强度范围
约为3 log单位，在此范围内的光刺激可引起细胞的瞬
间反应和稳定的持续反应，这种细胞反应特性与正常
的细胞反应电活动相似。此外，ChR2介导的光反应
电流足以使细胞去极化，其反应类似于ON双极细胞
和ON一持续反映神经节细胞的光反应类似。在ChR2
引起的光反应过程中，光刺激引起细胞去极化的动力
学反应非常迅速。对于连续持久的光照刺激，细胞持
续去极化反应过程中无明显的不应期。这些都说明，
表达ChR2的细胞在无RPE细胞的条件下，仍然可以
保持快速、持续的细胞反应¨01。
5 ChR2导入RP动物模型视网膜的生理学研究
小鼠体内rd纯合体基因突变可导致小鼠的遗传
性视网膜病变，这种小鼠被称为rd／rd(retinal
degeneration)小鼠，可作为人视网膜变性的动物模
型¨’”1。Cnga3一／一、Rho-／-双基因敲除小鼠以及
Pde6brdl(rdl)小鼠弘副也是进行人类遗传性视网膜病
变研究理想的动物模型，其特点是它的视细胞退行性
改变的病理过程与人类相似。在建立了正常鼠的
ChR2介导的光反应之后，作者将ChR2导入rd鼠的视
网膜，发现ChR2不仅可以在视网膜内核层细胞表达，
而且也表达于神经节细胞。此外，ChR2导入视网膜3
—6个月后依然可见ChR2的表达。在视网膜切片中，
作者利用细胞膜片钳技术可以记录到神经节细胞内
ChR2的光反应，其去极化率、细胞激发率均与光刺激
强度明显相关，表明导入ChR2的神经节细胞可在rd
鼠视网膜内编码视觉信息。用多电极矩阵
(muhielectrode arrays，MEA)技术记录神经节细胞的光
反应，可以观察到ChR2在视网膜铺片内的光反应及
ChR2在整个完整视网膜中的功能状况。结果显示，细
胞激发率与光刺激强度相关，这进一步证实导入的
ChR2通道具有编码视觉信息的功能…1。
为了证实rd鼠视网膜导入的ChR2光反应信号可
以传递至视皮层，作者利用视觉诱发电位(visual
evoked potential，VEP)来记录rd鼠的视皮层电活动，
并与正常鼠的视网膜进行比较。结果发现，ChR2在
rd鼠视网膜产生的视觉信息可以引起VEP反应，这说
明ChR2光反应信号可以精确地传递到视皮层，并且
可能在大脑内形成视觉。
6 halorhodopsin导入RP小鼠视网膜的生理研究
研究证明，RP患者的视杆细胞发生变性后，其视
锥细胞仍然可以存活相当长的一段时间Ⅲ。。利用RP
患者的这个特点，Busskamp等…1最近并lj用AAVs成功
将Natronomonas pharaonis halorhodopsin(eNpHR)转
导进入rd鼠的视网膜。eNpHR在光刺激条件下可以
激活氯离子泵，从而使细胞发生超极化反应。这与正
常的视细胞在光刺激条件下发生的细胞超极化反应过
程一致。RP模型小鼠(rd鼠)在生后53—264 d其视
杆细胞已全部消失，是进行RP基因研究的理想动物
模型。作者将eNpHR导入rd鼠的视网膜，并记录视
网膜细胞的电生理活动。结果发现，用580 nm波长的
光刺激视网膜后，细胞发生超极化反应，类似于正常的
视杆细胞活动，并且在神经节细胞记录到明显的光刺
激引起的兴奋电流，证明rd鼠的视网膜在视细胞受损
后，其内丛状层和外丛状层依旧保持着正常的神经突
触间的联系。此外，其神经节细胞引起的细胞反应仍
然有ON反应和OFF反应，其神经节细胞树突相应分
布于内丛状层ON或OFF层，更为重要的是，神经节细
胞能将其所编码的视觉信息传递到高一级的神经中枢。
侧支抑制是视网膜立体视觉形成的重要基础旧“。
研究发现，eNpHR导入的神经节细胞可以记录到ON
中心和OFF周边的典型侧支抑制引起的反应；另外，
神经节细胞的反应强度随着光刺激强度的增加而增
加，直到最大，随后细胞的反应强度却随着光刺激强度
的继续增加而下降。这也同样证明了视网膜侧支抑制
的存在。不仅如此，研究还表明，eNpHR导入后视网
膜的方向选择性神经节细胞，在不同移动方向的光斑
刺激下，可选择性地激发部分神经节细胞，更进一步说
明eNpHR导入后可使视网膜功能得以恢复。
然而，与正常视网膜不同的是，eNpHR导入后的
视网膜对光的敏感度有所下降，神经节细胞的光敏感
度和正常细胞相比下降了1．7 log单位。但是其最适
宜的光刺激波长在580 nm，这个波长正好处于人眼的
安全波长范围以内。用明暗箱实验测试eNpHR介导
后的小鼠，其行为学表现证实，随着光照强度的增加，
动物的行为表现出明显改善。这从行为学角度进一步
证明了eNpHR介导的视网膜可以恢复相当部分的功
能，从而引起以视觉功能为基础的整体行为的改善¨¨。
近来对导入视网膜的eNpHR进行了潜在毒性研
究，发现AAVs导入鼠视网膜6周后，视细胞没有观察
万方数据
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到进一步的损害。这说明应用AAVs将eNpHR转导
入视网膜是安全的。此外，由于通过AAVs将eNpHR
转导到人离体的视网膜的时间较长，需要2—3周的时
间。为了缩短eNpHR的导入人视网膜的时间，作者利
用慢病毒载体(Lentiviral vector)旧引进行转导，发现在
1—2 d后，即可在视网膜内获得eNpHR的高效表达。
总之，微生物型halorhodopsin被转导入RP残存
的视锥细胞后，可以使视网膜的ON和OFF通路重新
激活，视网膜的侧支抑制和方向选择性神经通路得以
重建。一般来说，RP患者的视锥细胞存活时间受细胞
因子和视杆细胞死亡后高氧环境因素的影响，然而，即
使在RP等疾病后期，只要视锥细胞胞体仍保留在
25％以上，就可以通过转导微生物型halorhodopsin，从
而达到挽救和恢复相当部分视觉功能的目的。由于正
常的视锥细胞可以对不同波长的光刺激产生反应，
AAVs导入eNpHR可以使视锥细胞重新恢复其光反
应功能，但通过AAVs导入eNpHR的视锥细胞无法区
分不同波长的光刺激，因此即使RP患者恢复了部分
视觉，也无法恢复其色觉。此外，正常人眼可以在
10 log单位的光照条件下工作，但是AAVs导入的
eNpHR其作用范围缩小至3 log单位，这种光强度类
似于正午的光照条件。因此，我们可以设计一种能提
高投射到视网膜光强度的眼镜，来补偿3 log单位的光
刺激强度的不足，使其可以达到足以激活eNpHR的光
亮度，最终恢复患者的视力旧“。
综上所述，利用基因治疗RP，通过光敏感通道蛋
白来改变残存细胞功能，最终可以使患者恢复其失去 |
