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眼科干细胞研究的现状及进一步研究的问题
2015-09-15 阴正勤 中华实验眼科杂志
·专家述评·
眼科干细胞研究的现状及进一步研究的问题
阴正勤李世迎 蹇骞
【摘要】干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，能通过非对称分裂的方式产生功能和类型更为局限的前体细胞及多种细胞系，进而再生新的细胞，参与损伤组织的修复和重建，是细胞移植研究和再生医学研究的主要对象。眼是一种由多种组织细胞和神经细胞组成的感觉器官，干细胞移植治疗眼科变性性疾病具有易操作、可视性好、所需种子细胞量少和排斥反应轻的优点，在干细胞基础研究和临床研究中受到广泛关注。国内外研究团队正在进行干细胞移植治疗眼部不可逆疾病的Ⅰ、Ⅱ期临床试验，中国经WHO注册的Ⅰ期临床试验也正处于病例招募阶段以评估干细胞移植治疗眼部疾病的疗效和安全性。目前，关于干细胞移植治疗眼部疾病的研究仍存在很多尚需解决的问题。本文中评述眼科干细胞移植研究的进展以及进一步的研究方向。
干细胞指一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，处于慢分裂周期，并能通过非对称分裂产生功能和类型更为局限的前体细胞或祖细胞及多种细胞系，从而再生新的细胞。根据其可分化成的细胞范围，干细胞可分为万能干细胞，即可以分化为胚胎和胚外组织的干细胞；多潜能干细胞，即只能形成胚胎组织的干细胞；多能干细胞，即只能定向分化成有限数目的细胞类型。根据干细胞来源分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs），ESCs指从5日龄人囊胚内细胞团中分离的多潜能干细胞，也包括诱导多潜能干细胞（inducedplurpotent stem cells, iPSCs），即通过重编程和去分化，从已分化的间质细胞诱导获得的具有ESCs特性的细胞；ASCs是存在于成熟器官特定区域内的干细胞，能够持续修复和再生相应组织，包括胎儿干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）。MSCs可从自体中取材，临床应用过程中不涉及伦理问题，并可克服移植后的免疫排斥反应，具有广泛的应用前景。眼部组织具有手术创伤小、移植细胞的需求量少、排斥反应轻、术中可活体直视下操作、形态和功能评估方法简便、对侧眼是良好的对照等优势，近年来已成为国际上干细胞研究的主要器官，相关的基础和临床研究进展非常迅速。与眼科相关的干细胞研究进展包括下列几个方面。
1角膜干细胞的基础和临床研究
1.1角膜缘干细胞
角膜缘干细胞（limbalstem cells, LSCs）位于角膜缘上皮基底层，具有自我更新和高增生潜能，但尚未发现绝对特异的LSCs标志物，目前用于识别LSCs的候选共表达标志物包括p63、ABCG2、CK19、α烯醇化酶、α9整合素、SOD2、角蛋白15、N钙黏素和Importin13，其中Importin13是由我国学者发现的。角膜受到损伤后LSCs可分化为角膜上皮细胞[1-2]。
临床上各种原因引起的LSCs损害可导致LSCs缺乏症（limbalstem cells deficiency, LSCD），严重者须进行LSCs移植，传统的手术方式包括异体角膜缘板层移植、带LSCs的自体结膜移植和亲属结膜移植，但大面积移植时对供者存在一定风险。目前也可对人角膜缘或口腔黏膜上皮来源的干细胞进行体外培养和扩增，形成重组上皮膜片，然后进行眼表重建，这些方法所需的供体材料少。近年来LSCs的培养方法逐渐趋于标准化，美国、日本、意大利和韩国已批准其用于临床治疗。我国谢立信团队以羊膜作为载体行同种异体角膜LSCs移植，在随访的1年中发现患者视力和角膜基质厚度无明显变化，影响术后角膜存活的危险因素是慢性感染和新生血管[3]，此外睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）可促进角膜上皮干细胞/祖细胞的扩增，促进角膜上皮愈合和神经再生，对于LSCD和糖尿病相关角膜病变有治疗作用[4]。
目前对于LSCs的基础和临床研究仍面临以下挑战：（1LSCs的特异性标志物、诱导激活和分化的调控信号、抑制新生血管的调控机制等研究仍待继续研究。（2)移植后供体LSCs的转归尚缺乏直接证据，需要进一步动物研究。（3)双眼和伴有其他并发症的LSCD治疗方案需要优化，尤其是眼表重建和功能恢复的问题[5]。
1.2角膜内皮细胞干细胞
角膜内皮细胞（cornealendothelial cells, CECs）干细胞主要位于人角膜周边内皮，其与小梁网之间可能有CECs干细胞/祖细胞的存在。这些细胞表达干细胞标志物Lgr5、Oct-3/4、Wnt-1、PAX6和SOX2等，能在体外扩增而形成克隆球，具有更长的端粒和更有活性的端粒酶以及更有活力的子代，推测其可能参与内皮损伤的早期修复和正常生理状态下的内皮更新。然而，CECs体外培养的增生能力有限，发挥促增生作用的生长因子还不明确，再生细胞的特性和功能与正常CECs仍有差距[6]。
2 晶状体干细胞的基础和临床研究
哺乳动物晶状体存在再生现象，再生来源于囊袋内残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)，由此提出了晶状体干细胞假说。直接分离犬类、猪、兔、鼠、人的LECs或体外培养晶状体囊袋均可获得LECs，此外也已建立了病毒转染后的永生化的LECs细胞系，目前也对兔、猫、狗、鼠的后发性白内障进行了在体研究。谢立信研究团队成功建立了BALB/c小鼠及SD大鼠后发性白内障（即晶状体再生）的动物模型。不过，晶状体干细胞的自我更新和分化潜能还需要更进一步验证，其定位也存在争议，此外如何获得与人正常晶状体结构和功能上更为相似的拟晶状体也需要进一步研究[7]。将灵长类猴或人的ESCs进行体外定向诱导分化可形成拟晶状体，其能表达晶状体特异性蛋白和结构基因，但其蛋白表达谱与人晶状体尚有差异[8]。
3视网膜干细胞的基础和临床研究
3.1 ESCs和iPSCs
3.1.1 ESCsESCs具有无限增生能力和向三胚层分化的潜能，其在眼科的定向诱导分化和移植研究取得了巨大的进展。ESCs诱导分化为视网膜色素上皮（retinalpigment epithelium，RPE）样细胞的方法包括自然分化法、基质细胞诱导法、无血清拟胚体悬浮培养法、小分子诱导法、视网膜决定法、神经球团分选法和3D视网膜诱导法等，用于年龄相关性黄斑变性（age-relatedmacular degeneration, AMD）和Stargardt病的移植疗法[9]，目前在美国加利福利亚大学、洛杉矶Stein眼科学院、Wills眼科医院、BascornPalmer眼科学院展开的hESC-RPE细胞悬液移植为前瞻性的非盲法、多中心临床I/II期临床试验，采用ACT公司提供的hESC-RPE（MA09-hRPE)对严重的干性AMD和Stargardt患者进行玻璃体切割-视网膜下腔移植，术后未发现黄斑皱褶、肿瘤形成、排斥反应等眼部并发症，偶见的全身性并发症可能与口服免疫抑制剂有关。接受治疗的18例患者中，13例视网膜下出现色素斑，占72%；10眼最佳矫正视力改善，占56%，视力不变者7眼，占39%，视力降低者1眼，占5%，而未处理眼无变化。尽管该临床试验纳入的样本量小，但对移植细胞的的长期存活率、安全性及其可能的生物学活性提供了强有力的证据[10]。最近韩国也首次报道了亚裔人种的hESC-RPE临床移植研究，该研究组将hESC-RPE移植到2例干性AMD和2例Stargardt患者眼内，移植后1年的随访期间3眼视力提高9~19行，1眼视力保持稳定，未发生RPE细胞的异常增生、成瘤、异常组织形成以及其他移植相关的安全问题[11]。除用hESC-RPE细胞悬液进行临床研究以外，hESC-RPE细胞植片移植的临床试验也在进行中，美国南加利福利亚大学眼科学院采用再生膜片技术（regenerativepatch technologies，RPT），以超薄高分子膜（聚对二甲苯）为载体制成hESC-RPE单层细胞植片，用于有中心凹萎缩的干性AMD和Stargardt者的临床I/IIa期试验，对移植后安全性和耐受性进行评估[12]。同期，受伦敦盲人治愈计划（LondonProject to Cure Blindness，LPCB）资助的英国伦敦大学学院也自行建立了hESC-RPE细胞植片，并培养在薄的聚酯膜上，其I期临床试验于2015年开始实施[13]。
然而，无论是用hESC-RPE细胞悬液或是细胞植片，仍需解决以下问题：如何通过ESCs获得数量多、具有多向分化潜能而且安全的种子干细胞；移植后的细胞如何整合到视网膜中并有效发挥相应的功能；不同疾病所需的移植细胞的种类、分化程度、移植量、移植方式等。
3.1.2 iPSCs iPSCs具有与ESCs类似的形态和分化能力，来源广泛，无免疫排斥且不存在伦理问题。人成纤维细胞来源的iPSCs能够在体外诱导分化为感光细胞、RPE细胞、视网膜神经节细胞等，移植后能够整合到小鼠视网膜中，并具有吞噬感光细胞外节盘膜，改善视网膜功能的作用[9,14]。2013年7月，日本批准了首例iPSC-RPE细胞植片移植治疗干性AMD的临床试验，该研究中将患者自体皮肤细胞诱导为iPSCs，并进一步诱导为iPSC-RPE单层细胞，培养于临时的凝胶支架上，于2014年9月首次将iPSC-RPE细胞植片移植到70岁老年女性AMD患者，术后6个月患眼视力再次下降，目前iPSCs诱导中的基因突变问题尚未得到解决，该研究已暂时中止[15]。另一项受LPCB资助的iPSC-RPE细胞植片移植研究项目也在进行中。研究者将iPSC-RPE单层细胞植片培养于聚酯支架上并用于干性AMD患者的临床治疗，并对术后的远期疗效及安全性进行评估[16]。
但是，由于iPSCs潜在的致瘤风险，其长期的安全性有待于进一步观察；而且iPSCs的分化效率还不高，导致其应用的成本高昂。
3.2 ASCs
3.2.1 MSCs MSCs包括骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derived stem cells, BMSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstem cells, ADSCs）和脐带血间充质干细胞（umbilical cord-derivedmesenchymal stromal cells, UBMSCs），BMSCs可避免免疫排斥反应，能够在体外大量扩增，还具有免疫调节和旁分泌效应，在视网膜疾病的治疗中得到了广泛的应用[9,14]。通过无创静脉注射MSCs的方式可对RCS大鼠进行治疗，发现术后视网膜感光细胞层厚度较对照组显著增加，视力改善，异常血管复合物和血管渗漏减少。RT-PCR和免疫组织化学检测提示眼内生长因子和神经营养因子表达量增加，该方法操作简便，患者耐受性好，可以反复多次治疗，是一种理想的治疗研究方向[17]。临床试验中应用较多的是BMSCs，BMSCs虽然来源于中胚层，但它具有向其他胚层以及中枢神经元和视网膜细胞分化的能力，已用于心肌梗塞、肝硬化、脑梗塞、AMD、糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy，DR）、视网膜静脉阻塞（retinalvein occlusion, RVO）、RP、遗传性黄斑变性、遗传性视网膜营养不良、视神经疾病、青光眼等多种疾病的临床研究。Jonas等尝试对1例DR玻璃体切割术后的患者进行自体BMSCs玻璃体腔注射，术后安全性好，但对视力没有改善[18]。目前多数研究都采用了BMSCs悬液视网膜下腔或玻璃体腔注射(10×106cells/ 0.1ml )的方式，前者手术创伤较大，重复治疗受限；后者有潜在的玻璃体腔内细胞增生的风险。美国的一个研究小组用巩膜脉络膜插入微管的方式将人脐带组织来源干细胞（humanumbilical tissue-derived stem cells，hUTSCs）细胞系CNTO2476悬液移植到干性AMD患者视网膜下腔，目前还没有I/II期临床试验的研究报道[19]。
迄止目前，关于MSCs能够分化为视网膜细胞的证据尚不充分，其发挥治疗作用的机制还有待进一步研究。大多数基础研究表明，BMSCs在体内难以向神经元和视网膜细胞分化，其改善视网膜功能的作用更可能是通过其抗炎、免疫调节、神经营养来实现的[16]。
3.2.2其他来源的ASCs 研究者还对其他多种ASCs进行了研究，包括视网膜前体细胞(retinalprogenitor cells, RPCs)、神经前体细胞（neuronal progenitorcells, NPCs）、胎儿视网膜神经上皮层及RPE层移植片。（1）RPCs 人RPCs体外分离扩增并移植到RCS大鼠视网膜下腔后12周，大鼠眼动反应性和视力较伪手术组显著改善，视网膜外核层厚度和细胞数量增加，提示人RPCs移植可延缓患者视力丧失的进程和视网膜形态的变化，可能与宿主感光细胞得到了保护有关。人RPCs移植后大鼠耐受较好，未见肿瘤形成等并发症[20]。我们实验室采用胚胎组织来源的人RPCs对RP患者进行视网膜下移植，术后随访1年，发现患者术后耐受较好，无免疫排斥反应等严重并发症，手术操作安全，患者视力得到一定程度改善。（2）近年来研究发现，与中枢海马来源的NPCs相比，大脑皮质来源的神经前体细胞（corticalneural progenitor cells, CNPCs）具有更好的向RPE细胞分化的能力。CNPCs移植到RCS大鼠视网膜下腔后明显改善大鼠视网膜功能，并可持续270d。对正常猕猴行CNPCs移植后能够在视网膜下腔形成单细胞层，对视功能没有影响，也没有出现严重并发症[14]。StemCells公司正在进行人胎儿神经干细胞（humanfetal central neuron stem cells, HuCNS-SCs）悬液移植治疗干性AMD的I/II期临床试验，以评估其初步的疗效及长期的安全性[21]。（3）胎儿视网膜神经上皮层及RPE层移植片 Aramant团队将9~16周的流产人胎儿视网膜神经上皮层及RPE层联合移植片植入到干性AMD或RP患者的视网膜下腔，随访1年后发现，4例干性AMD患者的视力均提高，6例RP患者中3例视力提高，1例视力稳定，2例视力下降；微视野的结果也证明了视功能改善。所有患者均未观察到免疫排斥反应[22]。
3.3视网膜内源性干细胞
3.3.1睫状缘干细胞 在视网膜周边与睫状体相连，具有原始干细胞/祖细胞存在的部位被称为睫状缘（ciliary margin zone，CMZ）。对鱼和两栖类动物的研究发现，CMZ干细胞分裂增生非常活跃，终生不断产生新的神经元整合到视网膜中，而鸡、鼠、人的CMZ干细胞处于休眠状态，仅在病理或损伤情况下才活化，但其分化的能力很有限，不能完成视功能的自我修复。将大鼠和小鼠的CMZ干细胞分离培养，均能够在体外形成克隆球，证实其具有自我更新的能力。胰岛素、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）-1、FGF-2、Shh（Sonic Hedgehog）等生长因子或信号分子能够在一定程度上支持CMZ干细胞的神经再生潜能，并诱导产生具有极性和吞噬功能的RPE样细胞。但是，如何在哺乳动物中在体激活这部分细胞并对其增生和分化进行调控目前仍是挑战，还需要进一步的研究[9,14,23-24]。
3.3.2视网膜Müller细胞Müller细胞成熟较晚，具有一定的RSCs祖细胞特征。Müller细胞是鱼类视网膜损伤后修复的最主要来源，可以完全再生视网膜神经元。哺乳动物Müller细胞也具有RSCs潜能，能够在FGF-2存在情况下体外增生形成克隆球，并向神经元分化，在视网膜损伤情况下也能够大量增生，产生新的视网膜神经元，替代缺失的细胞。移植的外源性干细胞，如RSCs、BMSCs，以及一些生长因子，如表皮生长因子和神经生长因等能够激活Müller细胞的神经再生潜能。根据损伤神经元和微环境的变化，Müller细胞能够分化表达多种视网膜神经细胞标志物，改善宿主视功能。但是，如何在哺乳动物中激活Müller细胞并对其增生和分化进行调控目前仍不清楚，Müller细胞的胶质化仍是影响其发挥干细胞/祖细胞特性的一大障碍[14,24]。
4研究者应当继续关注的相关问题
眼科干细胞研究因其独有的优势，已成为目前干细胞基础研究和再生医学临床研究中备受关注的领域，目前已在世界卫生组织国际临床实验注册平台（InternationalClinical Trials Registry Platform, ICTRP）以及美国国立卫生研究院（NIH）的ClinicalTrials.gov注册的多项临床试验已经证实眼科干细胞移植的安全性好，但其远期疗效是需进一步解决的瓶颈问题，一些临床试验已在病例招募阶段（表1）。随着国内外干细胞研究技术的进展和政府对相关研究支持力度的加大，干细胞移植治疗不可逆眼病的临床试验工作相继展开，我国眼科干细胞移植的临床研究也进入了新的阶段。眼科研究者应密切关注眼科干细胞移植研究的进展。目前要进一步改进的研究包括：（1）临床级低成本的稳定干细胞来源的种子细胞开发研究；（2）微创、可重复的临床移植方法优化；（3）干细胞移植后细胞的长期存活及免疫排斥反应的临床监测；（4）移植细胞与宿主细胞的功能联系。同时，眼科干细胞移植与其他领域最新研究进展的交叉融合，如干细胞与基因治疗的联合、干细胞与组织工程支架研究的联合以及动员高等哺乳动物的内源性干细胞的方法研究，也将为干细胞移植技术的临床应用打开新的思路。
表1 已注册的干细胞治疗眼底疾病的临床试验
注册号
时间
主要发起人/单位
受试
人数
细胞来源
疾病
移植方式
试验阶段
NCT01344993
2011/04-2015/09
Ocata Therapeutics, Inc.（美国）
16
hESC-RPE
(MA09-hRPE)
干性AMD
细胞悬液视网膜下腔注射
I/II
NCT01345006
2011/04-2015/09
Ocata Therapeutics, Inc.（美国）
16
hESC-RPE
(MA09-hRPE)
Stargardt黄斑变性
细胞悬液视网膜下腔注射
I/II
NCT02122159
2014/04-2015/09
Ocata Therapeutics, Inc.（美国）
N/A
hESC-RPE
(MA09-hRPE)
Myopic性黄斑变性
细胞悬液视网膜下腔注射
I/II
JPRN-UMIN000011929
2013/02/10-移植后4年
RIKEN Institute
（日本）
6
IPSC-RPE植片
渗出性AMD
细胞植片视网膜下腔移植
N/A
NCT01691261
2015/02-2017/11
Pfizer （英国）
10
hESC-RPE
(Pf-05206388)
湿性AMD
单层细胞支架视网膜下腔移植
I
NCT01674829
2012/09-2016/04
CHABiotech CO., Ltd （韩国）
12
hESC-RPE
(MA09-hRPE)
干性AMD
细胞悬液视网膜下腔注射
I/II
NCT01632527
2012/06-2015/06
StemCells, Inc （美国）
15
HuCNS-SC
干性AMD
细胞悬液视网膜下腔注射
I/II
NCT00345917
2006/06-2012/06
Radtke, Norman D., M.D（美国）
10
人胚胎神经视网膜组织和 RPE
RP
视网膜下腔移植
II
NCT00346060
2006/06-2012/03
Radtke, Norman D., M.D（美国）
10
人胚胎神经视网膜组织和 RPE
干性AMD
视网膜下腔移植
II
NCT01226628
2010/09-2019/11
Janssen Research & Development, LLC （美国）
24
hUTCs (CNTO 2476)
干性AMD
细胞悬液视网膜下腔注射
I
NCT01920867
2013/08-2017/08
Retina Associates of South Florida（美国）
300
hBMSCs
AMD、RP、缺血性视网膜视神经病变、视神萎缩、青光眼
细胞悬液玻璃体腔、视网膜下腔注射、球后注射、Tonon囊下注射、静脉注射
N/A
NCT01736059
2012/07-2015/12
University of California, Davis（美国）
15
BMSCs（CD34+）
干性AMD、 DR、RVO、 RP、遗传性黄斑变性
玻璃体腔注射
I
NCT01518127
2011/11-2015/12
University of Sao Paulo （巴西）
10
自体BMSCs
Stargardt黄斑变性、AMD
玻璃体腔注射
I/II
CTRI/2010/091/00639
2010/05/-(入组中)
Indian Council Of Medical Research, India （印度）
50
BMSCs
干性AMD、RP
玻璃体腔注射
I
ChiCTR-TNRC-08002365
2008/05-(入组中)
第三军医大学西南眼科医院（中国）
10
人视网膜祖细胞
RP
细胞悬液视网膜下腔注射
I
ChiCTR-TNRC-14004694
2014/05/-(入组中)
第三军医大学西南眼科医院（中国）
20
人BMSCs
RP
静脉注射
I
ChiCTR-TNRC-14005060
2014/07/-(入组中)
第三军医大学西南眼科医院（中国）
20
人UC-MSCs
RP
静脉注射
I
ChiCTR-OCB-15006423
2015/05/-(入组中)
第三军医大学西南眼科医院（中国）
10
hESC-RPE
Stargardt黄斑变性、AMD
细胞悬液视网膜下腔注射
I
注： WHO国际临床实验注册平台（http://ctri.nic.in/Clinicaltrials/login.php）；美国国立卫生研究院（NIH）临床实验注册平台（https://clinicaltrials.gov/）；HuCNS-SCs：人中枢神经系统干细胞；hUTCs：人脐源性细胞；hESC-RPE：人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮；BMSCs：骨髓源性间充质干细胞；UC-MSCs：脐带源性间充质干细胞；AMD:年龄相关性黄斑变性；RP：视网膜色素上皮变性；DR：糖尿病视网膜病变；RVO：视网膜静脉阻塞；N/A：未填写 |
