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1B型Usher综合症的基因治疗策略
David S. Williams and Vanda S. Lopes
关键词：腺病毒；基因治疗；慢病毒；色素粒；MYO7A；光感受器；视蛋白；视网膜色素上皮细胞；Usher综合症
31.1 引言
1型Usher综合症是以深度先天性耳聋为特征，继以进展性视网膜变性。1B型Usher综合症患者约占一半以上的1型Ushers综合症病人(Astuto et al. 2000 ; Bharadwaj et al. 2000 ;Ouyang et al. 2005 )，由MYO7A基因突变所导致，此突变基因编码了一个非传统的肌球蛋白(Weil et al. 1995 )。
现在常用耳蜗植入来治疗1型Ushers综合症病人的耳聋。接受这种植入的婴儿能很好地融入社区生活，大部分能上这流学校(Blanchet et al. 2007 ; Liu et al. 2008 )。目前没有治疗他们接踵而至的视网膜变性，但是，1B型Usher综合症似乎非常适合基因治疗，这种基因治疗涉及补充一个野生型基因。首先，1B型Usher综合症是隐性遗传的，说明它是由MYO7A功能丧失所导致。关于Myo7a-1型Usher综合症患者的研究也支持这个结论。其次，因为先天性耳聋，在任何进展性视网膜变性开始之前，1型Usher综合症患者通常可进行早期遗传学鉴定。除了感光细胞丧失之外，许多视网膜变性患者还涉及可逆转的内部视网膜的重构(Jones and Marc 2005 )，因此早期就用基因治疗很重要。本文中，我们讨论了基因治疗策略，即为防止失明用不同病毒将MYO7A传递至视网膜。
31.2 MYO7A基因
MYO7A基因长约100kb，编码区不到7kb (Chen et al. 1996 ; Weil et al. 1996 ; Kelley et al. 1997 ; Levy et al. 1997 )。它编码的蛋白质包含有一个肌球蛋白马达头，一个杠杆臂，一个假定的卷曲螺旋和一个尾巴(Fig. 31.1 )。杠杆臂结合轻链，包括钙调蛋白（(Udovichenko et al. 2002 ) ；尾巴域含有一个重复的MyTH4 – FERM域(Chen et al. 1996 ; Weil et al. 1996 )。已沿MYO7A序列鉴定出造成I型Usher综合症的突变。它们是一些分布在各个区域内的错义突变，这些区域分别是：马达域(Weston et al. 1996 )，第一个MyTH4域(Cuevas et al. 1999 ; Bharadwaj et al. 2000 )，第一个FERM域(Janecke et al. 1999 )，第二个MyTH4域(Bharadwaj et al. 2000 )和第二个FERM域(Bharadwaj et al. 2000 ; Jacobson et al. 2009 )，这意味着整个cDNA（而不是“小基因”版）是成功治疗所必要的。
Fig. 31.1 MYO7A结构域示意图 IQ：异亮氨酸-谷氨酰胺模序；MyTH4：肌球蛋白尾同源域4；FERM：4.1带、埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白；SH3：Scr同源域3
大部分MYO7A存在于视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium， RPE)中，就象最初大鼠视网膜免疫荧光研究所表明的那样(Hasson et al. 1995 )。El-Amraoui报道这个蛋白也存在于两栖动物、鸟类和灵长类的感光细胞中，尽管他们在啮齿类视网膜中没有检测到这种蛋白(El-Amraoui et al.，1996 )。后续的免疫电子显微镜研究与Myo7a- 突变小鼠的表现型研究也表明MYO7A位于光感受器连接纤毛区域内，并在这个区域内发挥功能(Williams 2008)。
在人视网膜cDNA文库中检测到MYO7A的两种主要亚型。它们因34号外显子5’端的一段114bp片段的存在或缺失而不同(Weil et al. 1996 )。但是，这两个亚型的表达定量分析已经肯定只有较短的亚型在光感受器细胞和RPE细胞中有明显表明(结果未发表)，意味着只递送入较短亚型的cDNA编码序列就足够基因治疗了。
31.3 Myo7a- 突变小鼠
已有Myo7a- 突变小鼠，其中Myo7a突变与1B型Usher综合症基因同源(Gibson et al. 1995 ) .。大量等位基因中至少有一个shaker1 4626SB 是无效的(Hasson et al. 1997 ; Liu et al. 1999 )。Myo7a- 突变小鼠象1B型Usher患者一样，耳聋且有前庭功能障碍，但是无等位基因出现视网膜变性(Lillo et al. 2003 )。然而，在RPE细胞和感受器细胞中都鉴定出突变表现型(Fig. 31.2 ).。在RPE细胞中，黑色素被错误定位并有异常活力(Liu et al. 1998 ; Gibbs et al. 2004 ; Lopes et al. 2007)。吞噬体也被错误定位，更慢地消化(Gibbs et al., 2003)。在感光细胞中，连接纤毛中视蛋白浓度的增加意味着外节基质的缺陷输送和/或远端纤毛扩散膜故障(Liu et al.，1999)。这些突变体表型符合功能性蛋白存在的检测。这些突变体的表型是服从实验测试是否存在功能性蛋白，因此可用于实验性检测Myo7a突变小鼠基因治疗的效能。
RPE和感光细胞中MYO7A的定位与Myo7a突变小鼠RPE和感光细胞中表现型的存在一起表明，要达到成功的视网膜基因治疗，RPE细胞与感光细胞中必需转入野生型MYO7A。这已被一项小鼠研究所确证，这些小鼠的组织中包含有有MYO7A和无MYO7A的细胞，因此在邻近的RPE细胞中，表现出细胞自发的而不是继发的缺失MYO7A。
31.4 慢病毒介导的基因治疗
第一个测试MYO7A基因治疗有效性的实验使用HIV-1源性慢病毒来携带MYO7A的cDNA，然后注射入无Myo7a小鼠的视网膜下腔内(Hashimoto et al. 2007)。使用的是两个主要亚型中较小的一个（即缺失114bp片段的那个）。发现RPE细胞中有MYO7A表达，是由一个嵌合启动子来驱动的表达，这个启动子含有一个来自CMV(巨细胞病毒)和天然MYO7A启动子的元件。在感光细胞中检测不到MYO7A的显著水平，但是在注射域的RPE与感光细胞内，对校正的表现型来说，少且足够量的MYO7A就被认为是明显的。正如对能在不同位点整合入染色体的病毒所预期的一样(Bushman 2003 ; Mitchell et al. 2004)，不同RPE细胞中MYO7A的产生水平各异，且平均水平低于野生型65%的细胞仍有错误定位的黑素体(Hashimoto et al. 2007)。最近，这项研究已用马传染性贫血病病毒(EIAV)和相同的CMV-MYO7A启动子进行重复实验。在此研究中，获得了高滴度（即病毒毒力）的病毒，接着注射，在感光连接纤毛和RPE细胞中都检测到野生型水平的MYO7A(未发表)。
为了消除转染细胞中的可变表达及非期望插入诱变可能性，一种办法就是用整合缺陷的慢病毒（Yanez-Munoz et al. 2006）。成熟的RPE和感光细胞不再分化，因此对于维持引入基因来说，整合不是必需的。初步实验结果表明，HIV-1基源慢病毒能如上所述那样以相似效力校正突变表现型RPE和感光细胞，其中这些慢病毒携带有MYO7A基因，是滴度相当的整合擅长型和整合缺陷型HIV-1基源慢病毒。
31.5 AAV介导的基因治疗
在基因治疗目前最成功的一个临床应用中，就是用腺相关病毒（AAV）来递关RPE65的cDNA到RPE细胞，因而改善先天性利伯氏黑蒙（Leber’s congenital amaurosis， LCA）患者的视力，这些患者是由RPE65突变所导致的(Bainbridge et al. 2008 ; Cideciyan et al. 2008 ; Hauswirth et al. 2008 ; Maguire et al. 2008 )。但是，AAV不适合于递送MYO7A的cDNA，因为MYO7A的cDNA比AAV报道的递送能力还要大1-2kb (Grieger and Samulski 2005)。然而，我们测试了一个携带MYO7A基因cDNA和CMV启动子的AAV5载体是否影响MYO7A在来自无Myo7a基因小鼠的RPE原代培养细胞中的表达。MYO7A蛋白的蛋白质杂交结果表明了MYO7A的转导与表达(Fig. 3 in Allocca et al. 2008)。
最近研究已经发现，大于5kb的基因组只能部分地被AAV包装(Dong et al. 2010 ; Lai et al. 2010; Wu et al. 2010)，导致形成更大基因组片段，没有一个比5kb更大，这个结果与早期AAV包装限度的研究相一致(Grieger and Samulski，2005)。但是，一些最近研究也表明：在接下来的感染中，此片段可被重新组装入比衣壳限度更大的转基因中，说明了AAV载体递送MYO7A的cDNA的能力。 |
