视网膜变性疾病，包括视网膜色素变性和老年性黄斑变性，可导致感光细胞逐渐丧失或永久性损伤，从而造成严重的视力损害。然而，尽管感光细胞变性，视网膜内部神经元（神经节细胞和双极细胞）仍可得以保留。用于刺激视网膜神经元的电子视网膜假体有望恢复视力。然而，传统视网膜植入物的刚性电极会对柔软的视网膜组织造成损伤。此外，由于它们与变性视网膜中的靶细胞距离较近，因此选择性有限。
来自韩国釜山大学的 Seung Geol Lee团队和来自韩国延世大学的Suk Ho Byeon和Jang-Ung Park团队开发了一种软性人工视网膜（厚度为 10 微米），其中柔性超薄光敏晶体管与共晶镓铟合金3D刺激电极融为一体。仅在这些3D液态金属电极顶端局部涂覆的铂纳米团簇在降低刺激电极阻抗方面具有优势。这些微电极能增强与目标视网膜神经节细胞的接近度，并提供有效的电荷注入（72.84 mC cm-2），以引起视网膜中的神经反应。由于其液态形式，它们的杨氏模量较低（234 kPa），可以最大限度地减少对视网膜的损伤。此外，本研究还使用了一种无监督机器学习方法来有效识别诱发的尖峰，从而对视网膜神经节细胞内的神经活动进行分级。视网膜变性小鼠模型的体内实验结果表明，在选择性的局部光照区域下，视网膜上神经反应的时空分布可以被绘制出来，这表明它们的视力得到了恢复。相关工作以题为“LiquID-metal-based three-dimensIonal microelectrode arrays integrated with implantable ultrathin retinal prosthesis for visIon restoratIon”的文章发表在2024年01月15日的国际顶级期刊《Nature Nanotechnology》。
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1. 创新型研究内容
本研究介绍一种软性人工视网膜，它将柔性、超薄和光敏晶体管阵列与液态金属（LM）的软性3D刺激电极集成在一起，用于视力恢复。首先，与视网膜下植入术相比，这种软性人工视网膜采用更安全的视网膜外植入方法，对视网膜的创伤更小。其次，柔软且具有生物相容性的 LM 被 3D 打印成高分辨率的刺激电极。对 LM 的研究包括其特性（低模量和无限弹性极限）和加工方法（打印和图案化），以便将其用于电子产品。然而，将 LM 用作生物界面材料的研究还处于早期阶段。镓基 LM（如共晶镓铟合金（EGaIn））本质上很软，而且毒性低。与以往使用刚性材料的柱状/尖刺电极相比，这些软性3D刺激电极的模量低，可最大限度地减少对视网膜的不良损伤。此外，在这些 LM 电极的顶端局部涂覆铂（Pt）纳米团簇也显示出了有效地向视网膜神经元注入电荷的优势。第三，对动物实验中产生的输出信号进行了机器学习，从而可以分析诱发的 RGC 峰值。最后，活体实验证实，可见光照射引起的信号放大，会在光入射的局部区域诱发视网膜变性（rd1）小鼠RGC的实时反应，而这些小鼠的感光器已大量变性，这表明它们的视力已经恢复。
【带有 3D LM 微电极阵列的软人工视网膜】
图 1a 显示了一个人造视网膜，其3D LM 微电极紧贴着不均匀的退化视网膜表面。这种超薄、柔韧的装置贴合在视网膜最内层表面，软质 LM 的柱状探针直接刺激 RGC。图 1b 是该装置的布局示意图。3D EGaIn 微柱阵列直接打印在光电晶体管的漏极表面，在室温下形成刺激电极。然后，用对二甲苯 C 层封装柱的侧壁。在电镀铂纳米团簇之前，使用各向异性 O2 反应离子刻蚀（RIE）打开柱尖，作为视网膜组织的电荷注入点，称为铂黑（PtB）。PtB 涂层为这些3D LM 微电极增加了纳米级的粗糙度，大大增加了它们的电化学表面积。当外部光线照射到光电晶体管上时，半导体通道内会产生光电流，从而放大漏极电流（ID）。入射光产生的放大 ID 表明，通过3D LM 微电极的泄放电压（VD）脉冲刺激，注入 RGC 的电荷大幅增加。然后，RGC 内诱发的动作电位可传递到视神经，从而替代视觉信息。图 1c 展示了这种人工视网膜，它将高分辨率晶体管阵列与 3D LM 微电极集成在一起。在这个样品中，晶体管阵列的每个漏极都形成了3D LM 微电极（高度 60 微米，直径 20 微米）（图 1d）。图 1e 显示了3D LM 微电极顶端局部涂覆的 PtB。这对3D打印 EGaIn 的弹性模量的改变可以忽略不计，其弹性模量与生物组织相当，明显低于刚性固态电极。另一方面，这些传统电极的长期植入受到了限制，因为在与视网膜连接时会对脆弱的视网膜组织造成相当大的损伤。尽管 Argus 植入体在植入十年后仍能正常工作，但有报告称视网膜表面与设备的刚性组件之间存在差异。这种不匹配增加了它们之间的几何间隙，导致阻抗大幅降低，但刺激阈值却增加了，从而限制了对视网膜的有效刺激。
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图1 带有 3D LM 微电极阵列的软人工视网膜
【软人工视网膜的特性】
人工视网膜中的光电晶体管的电流-电压（I-V）特性（图 2a、b）显示了不同光照强度下的典型光敏场效应晶体管行为。计算得出环境条件下的场效应迁移率为 ～341 cm2 V-1 s-1。开/关比率（Ion/Ioff）和阈值电压（Vth）分别为 1.61 × 106 和 2.6 V。光电晶体管的快速响应和恢复时间分别为 10 毫秒和 13 毫秒，滞后现象可以忽略不计（图 2c）。该光电晶体管 ID 的相对变化（ΔID/I0）与事件光强度成线性比例（图 2d；I0 为黑暗状态下的 ID，ΔID = ID - I0）。过光电晶体管阵列，可以观察到光线在光照过程中穿过鹰形阴影掩膜图案的情况（图 2e）。为了制作作为刺激电极的柱形3D LM 微电极阵列，本研究使用了高分辨率打印系统直接打印的方法（图 2f）。EGaIn 柱的直径由玻璃毛细管喷嘴的内径决定（图 2g）。通过调节平台的垂直下降速度，可以控制柱子的高度（图 2h,i）。此外，使用不同直径的喷嘴打印出的药柱高度足以靶向视网膜神经元。
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图2 光电晶体管阵列的光电特性和 3D LM 微电极的电化学特性
【体外电生理实验】
使用带有3D LM 微电极（高度 60 μm；图 3a）的人工视网膜，通过电刺激测试野生型（WT）和 rd1 小鼠视网膜（n = 5）的反应。为了记录视觉或电诱发的视网膜反应，每个记录电极都与每个刺激电极相邻（间距 40 μm）（图 3b）。将 WT 和 rd1 小鼠的离体视网膜放在该装置上，3D LM 微电极朝向视网膜的 RGC 侧。植入前，将装置置于冷库中（低于 EGaIn 的熔点，即 ～15.7℃）瞬间冷冻，使液相 EGaIn 变成固态。3D LM 微电极在植入视网膜后恢复了液相，没有发生塌陷。在进行电刺激时，装置的晶体管在特定条件下工作（VG，直流偏压 5 V；VD，脉冲偏压 1 V，持续时间 1 ms，频率 10 Hz），并使用相邻的记录电极进行记录。由于小鼠是双色哺乳动物，只有两种锥体类型（对蓝光和绿光敏感），因此使用蓝光（470 nm）。在这种光照下记录视觉诱发电位（VEP）而不操作仪器，而在黑暗状态下记录电诱发电位（EEP）而操作仪器。在 rd1 小鼠视网膜上，光线并未诱发视网膜反应（图 3c）。然而，在设备运行期间，电刺激可以在 WT（68 μV）和 rd1（62 μV）小鼠视网膜中引起 EEP 幅值相当的 RGC 尖峰。当对 WT 和 rd1 小鼠视网膜（在黑暗状态下）进行单脉冲电刺激时，记录到的 rd1 小鼠视网膜活动比 WT 小鼠更早、更明显地增加了发射活动（图 3d）。已知 rd1 小鼠视网膜的形态变化（包括 RGC 大小和核内层厚度的减少）会影响 RGC 的功能特性，导致刺激阈值升高和潜伏期延长44。在不同强度的光照下，WT 小鼠和 rd1 小鼠视网膜分别使用平面型电极（高度为 0 μm），在设备运行过程中诱发 EEPs（图 3e,f）。在 WT 小鼠和 rd1 小鼠视网膜中，诱发的 RGC 穗状点的发射率与光照强度成正比增加（图 3g）。与 rd1 小鼠相比，WT 小鼠视网膜由于其正常感光层的原生反应而显示出更高的发射率。
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图3 使用 WT 和 rd1 小鼠视网膜进行体内外实验
【利用机器学习进行信号处理】
考虑到视网膜活动的复杂性，本研究利用无监督机器学习进行信号处理。在初级分类中，本研究将视网膜尖峰值作为输入数据，通过分层聚类对 4992 个尖峰进行了分类。根据信号的大小和形状，给定数据被分为不同的簇（图 4a）。视网膜尖峰数据被进一步分类为电位值大小不同的四个簇（图 4b）。这些分类后的视网膜尖峰数据通过无监督机器学习进行分析，以获得平均信号及其标准偏差。群组 1、2 和 3 中同一群组内的信号显示出相似的电位值形式和时间长度（图 4c-e）。
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图4 利用无监督机器学习进行信号分类
【活体 rd1 小鼠的体内视力恢复】
本研究将带有3D LM 微电极的人工视网膜装置植入活体 rd1 小鼠体内（n = 3）。实验前，本研究首先确认了光感受器层已完全退化。用外部设备连接装置后，将(1)全场照明（470 纳米）或(2)连续激光照射（415 纳米）通过椭圆形图案的阴影掩膜施加到眼底。该装置与视网膜表面附着良好，无明显损伤或出血（图 5a）。手术后获得的横截面光学相干断层扫描图像显示，3D LM 微电极被视网膜组织保形包围，没有塌陷（图 5b）。本研究进一步关注了3D LM 微电极植入后的塌陷情况，在将总共 180 个电极植入 rd1 小鼠视网膜（n = 5）后，通过光学相干断层扫描图像测量了电极柱的倾斜角度，验证了植入的电极没有塌陷。在植入人工视网膜后，通过将可见光投射到其视网膜上记录 EEPs（图 5c）。本研究记录了恒定光照下诱发尖峰的电位和发射率的实时轨迹，并对光照期间的发射率进行了空间映射（图 5d，e）。与没有光照的情况相比，记录到的反应显示出一致的电位大小和诱发尖峰的发射率，这表明使用该装置刺激视网膜区域具有良好的一致性。
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图5 利用活体 rd1 小鼠进行视力恢复的体内实验
2. 总结与展望
本研究报告了一种软性人造视网膜，它由高分辨率、柔性光电晶体管阵列和直接打印的3D LM 微电极组成，能够对视网膜进行微创刺激。活体实验证明，可见光照明可诱导光入射的局部视网膜区域的RGC发生尖峰活动，这表明rd1小鼠有可能恢复视力。这些结果对于为不均匀视网膜变性患者开发个性化人工视网膜具有预后意义。虽然由于小鼠眼球较小（直径为 3 毫米），体内实验中使用的设备仅限于 36 个像素，但设备尺寸的进一步扩大和像素数量的增加将使其能够应用于眼球更大、视网膜更厚的大型动物模型。此外，本研究的打印系统还能将 3D LM 微电极的直径缩小到 5 微米。这样就能制造出具有3D LM 微电极的高分辨率设备，理论上相当于 20/160 的视力。缩小刺激电极尺寸对实现高分辨率刺激至关重要。然而，随着刺激部位尺寸的减小，阻抗也会增加，从而限制了有效刺激。进一步研究纳米级材料（如铂纳米团簇），通过在电极表面增加纳米级粗糙度来提高刺激效果，可能是未来实现更高视力的有趣工作。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41565-023-01587-w |
