结晶样视网膜变性小鼠的基因治疗-北京协和医院眼科与中科院动物所团队的合作研究
结晶样视网膜变性（Bietti crystalline dystrophy, BCD）是一种严重的致盲性视网膜退行性疾病，该病的致病基因为CYP4V2，为常染色体隐性遗传。其典型的临床特征为视网膜的黄白色结晶沉积，疾病晚期合并视网膜色素上皮及脉络膜毛细血管萎缩，同时合并脂类代谢异常。BCD在欧美人群少见，在亚洲人群多见，尤其多见于中国与日本人群，是我国遗传性视网膜变性中最常见的类型，但是目前尚无有效的治疗手段。BCD患者通常在青少年时期出现夜盲、视力下降和视野缩小等症状，多数在中年时期由于视力严重下降及视野缩小而成为法定盲人。目前基因治疗是该病最有希望的治疗方式，尽管既往已有BCD的小鼠模型，但其表型与人类患者有差异，很难作为进一步治疗研究的模型。因此北京协和医院眼科睢瑞芳团队与中国科学院动物所李伟团队进行合作，重新构建BCD的小鼠模型并进行基因治疗的研究，相关文章“Treating Bietti Crystalline Dystrophy in a High-Fat Diet-Exacerbated Murine Model Using Gene Therapy”于6月1号在线发表在Gene Therapy杂志上。
构建Cyp4v3基因敲除小鼠
小鼠Cyp4v3基因为人类CYP4V2的同源基因（图1A）。将设计好的SpCas9 mRNA 和sgRNAs注射入小鼠受精卵中，Sanger测序发现8个子代中有5个含有整个Cyp4v3基因的缺失突变。其中2只表现出高比例的Cyp4v3缺失细胞（图1B和C）。Southernblot分析也显示Cyp4v3基因的完全缺失（图1D）。交配繁殖获得Cyp4v3-/-小鼠用于下一步的研究。
24周龄Cyp4v3-/-小鼠的ERG有轻微改变（图1e），但是与野生型小鼠相比没有明显差异（图1F）。在对其进行24周的持续观察发现，Cyp4v3-/-小鼠与野生型小鼠ERG基本上没有差异（图1G）。但是在Cyp4v3-/-小鼠中发现了眼底病变（图1H）。由于BCD是一种进展性的视网膜变性，这些结果表明Cyp4v3-/-小鼠的视网膜病变比BCD患者的视网膜病变要轻，但是Cyp4v3-/-小鼠的表型也反映了疾病进展缓慢的特点。
图1.Cyp4v3-/-小鼠的构建和长期观察
高脂饲喂加速并加重BCD的疾病进展
既往在BCD患者的血清及细胞中发现脂肪酸异常。但尚不清楚它们是缺乏CYP4V2的非特异性代谢的结果，还是加重BCD患者视网膜病变的致病因素。研究者对Cyp4v3-/-小鼠进行高脂饲料（high-fat diet，HFD）喂养并观察它们的眼底表现（图2A）。仅经过8周的饲喂，就在大多数Cyp4v3-/-小鼠中观察到ERG明显下降（图2B）。并在视网膜上发现了大片的黄白色斑片病变（图2C）。OCT上也显示视网膜外层的高反射信号积聚（图2C）。
通过分析Cyp4v3-/-小鼠视网膜病变的发生时间，研究者发现HFD组病变发生的年龄明显早于正常饲喂（normal diet，ND）组（图2D）。以上结果表明，食物获取的脂质是BCD患者的潜在危险因素，它不仅加重且加速了Cyp4v3-/-小鼠视网膜病变的出现。
12周龄的HFD Cyp4v3-/-小鼠的ERG明显低于ND或者HFD的野生型小鼠（图3A）。说明了在缺乏Cyp4v3基因的小鼠中，食物摄取脂质确实是疾病的危险因素。同时ND Cyp4v3-/-小鼠的ERG与野生型小鼠没有差异（图3A）。这些结果证明，HFD诱导的Cyp4v3-/-小鼠模型可以模拟BCD患者视网膜的功能下降。
为了确定HFD对小鼠模型的持续性作用，对HFD Cyp4v3-/-小鼠进行持续观察，发现HFD Cyp4v3-/-小鼠的ERG在各个年龄均明显低于野生型小鼠（图3B）。而ND Cyp4v3-/-小鼠与野生型小鼠没有明显差异（图3B）。说明HFD所诱导的ERG下降并没有随着时间而减弱（图3B）。
对HFD和ND Cyp4v3-/-小鼠和野生型小鼠进行血清的脂代谢检测，发现与野生型小鼠相比，在HFD和ND Cyp4v3-/-小鼠中有4组FFA（FFA22:6, FFA18:3, FFA18:2和FFA18:1）同时降低，而FFA18:0在HFD Cyp4v3-/-小鼠中升高。
图2.高脂饲喂加重和加快Cyp4v3-/-小鼠的眼底病变的出现
图3.高脂饲喂Cyp4v3-/-小鼠的ERG改变
scAAV8-hCYP4V2基因治疗改善Cyp4v3-/-小鼠的病变
在HFD Cyp4v3-/-小鼠的双眼视网膜下分别注射1ul2e12vg/ml的scAAV8-hCYP4V2和scAAV8-eGFP对照眼（图4A）。视网膜下注射后局部视网膜隆起（图4B），并通过OCT确认注射效果。免疫荧光检测发现注射后的视网膜细胞有GFP的高表达（图4C），表现出高效的基因表达。而且在治疗后病变似乎也相对缩小（图4D），提示可能的治疗作用。
注射前Cyp4v3-/-小鼠左右眼ERG没有差异（图5A,B），在视网膜下注射8周后，注射scAAV8-hCYP4V2的治疗眼的ERG明显高于注射scAAV8-eGFP的对照眼（图5C，D），说明了基因治疗能恢复小鼠的视功能。在注射后16周仍有明显的治疗效果（图5E，F）。而治疗眼的RPE和感光细胞层厚度也明显增厚（图5G,H）。另外与血清脂类检测相比，HFD Cyp4v3-/-小鼠RPE的脂类分析发现FFA18:3的含量相比野生型小鼠也偏低，可在治疗后FFA18:3含量又有所恢复，提示FFA18:3可能是scAAV8-hCYP4V2治疗恢复的代谢产物（图6）。
图4.基因治疗方案和视网膜评估
图5. AAV注射后ERG和视网膜厚度的评估
图6. RPE脂肪酸的分析
综上所述，本研究构建了一个Cyp4v3缺陷的小鼠模型，并发现高脂饲喂能加重其眼底病变的进展，可以作为基因治疗的理想模型，并确定了病变中变化的脂类成分。而视网膜下注射scAAV8-hCYP4V2的基因治疗能恢复小鼠模型的视网膜功能，异常的眼底病变和脂类产物。为下一步人类BCD患者的基因治疗试验奠定基础。北京协和医院睢瑞芳教授和中科院动物所李伟研究员为本论文的共同通讯作者；曲彬、吴世靖、焦贯怡、邹绚、李治琨、郭璐为共同第一作者。
参考文献：
Treating Bietti Crystalline Dystrophy in a High-Fat Diet-Exacerbated Murine Model Using Gene Therapy.Gene Ther. 2020 Jun 1.
点评
我国人群BCD患病率显著高于其他国家，是我国遗传性视网膜变性(IRD)中最常见的类型，大约占15％。BCD给我国社会发展造成沉重负担，对患者的生活质量带来巨大影响。但是针对该病的研究较少，对其发病机制的认识非常有限，是现代医疗亟需攻破的重要难题之一。该研究首次采用高脂饲喂加速BCD小鼠发病，成功建立了BCD小鼠模型；探索了高效安全注射模式，并对视网膜下注射治疗后CYP4V2转染表达情况以及小鼠视网膜功能进行了评估。初步证明了该病基因治疗的效果和安全性，为我国高发的遗传性疾病BCD提供了一种可能的治疗途径，为进一步的临床转化提供了可靠的数据。2017年底美国FDA批准了针对RPE65基因缺陷导致的遗传性视网膜变性基因治疗新药Luxturna上市，IRD基因治疗时代开启。期待不久的将来BCD基因治疗能够给广大患者带来光明。
北京协和医院
睢瑞芳 |
