【综述】干细胞治疗视网膜退行性疾病
原创： 张珂凡 等 中华实验眼科杂志 昨天
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张珂凡 综述 曲秀霞 范国平 审校
214122无锡，江南大学无锡医学院（张珂凡、曲秀霞）；90095美国洛杉矶，加州大学戴维格芬医学院人类遗传学系（范国平）
通信作者：范国平，Email: gfan@mednet.ucla.edu
DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2018.11.011
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张珂凡，曲秀霞，范国平. 干细胞治疗视网膜退行性疾病[J]. 中华实验眼科杂志, 2018, 36(11):871-877. DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2018.11.011.
【摘要】 眼是人类的重要器官，而视网膜退行性疾病可致盲，给患者带来极大的痛苦。在目前的条件下，细胞移植是治疗退行性眼病的重要方法之一。由于成体干细胞数量稀少，因此激活内源性成体干细胞来治疗退行性眼病还很困难，利用多能干细胞，包括胚胎干细胞（ESCs）以及诱导性多能干细胞（iPSCs）分化得到的光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞便成为有效的移植细胞来源。本文介绍视网膜退行性疾病中危害较大的视网膜色素变性（RP）和年龄相关性视网膜黄斑变性（AMD）的病理过程以及干细胞移植治疗退行性眼病的发展现状，对退行性眼病中2种不同的易损细胞，即RPE细胞和光感受器细胞干细胞疗法研究现状进行综述，并对干细胞移植治疗退行性眼病现阶段存在的问题和未来的发展方向进行了探讨。
【关键词】年龄相关性黄斑变性；视网膜色素变性；诱导性多能干细胞；视网膜色素上皮；光感受器；细胞移植治疗
视网膜退行性疾病主要包括视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）、黄斑变性以及遗传性Leber病等，这些疾病存在着不同的症状以及相关致病基因或易感基因（表1）。尽管这些疾病的病因和病理进程各不相同，但都存在视网膜细胞数量的进行性减少，主要包括视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）和光感受器细胞的不可逆损失，并最终导致视觉功能丧失。RP为遗传性疾病，目前已发现200多个与RP相关的基因突变位点[1]。黄斑变性是由基因改变和环境因素共同引起，根据患病年龄分为少年黄斑变性和年龄相关性黄斑变性（age related-macular degeneration，AMD)[2]。临床上RP和AMD较为普遍，其中RP的发病率高达1/3 000；而AMD在大于60岁的人群中的发病率超过1/10[3-4]。目前，临床上用来治疗视网膜退行性疾病的药物和方法非常有限，多数为抗炎治疗及神经细胞营养保护性药物用以延缓病程，或者抑制血管生长类药物以治疗湿性AMD等。但是药物治疗无法恢复已经受损的视神经细胞和功能RPE细胞，而利用细胞移植手段则可以有针对性地将有特定功能的细胞移植并整合到视网膜中以恢复其受损功能，应用前景更为广泛。因此本文着重介绍了RP以及AMD的病理过程以及细胞移植治疗现状。
1视网膜退行性疾病的病理过程以及影响因子
1.1 RP的病理过程以及影响因子
综合征性RP伴随其他神经系统疾病或者发育异常出现，而非综合征性RP则是单独出现[5]。RP早期会出现夜视能力下降以及中周部视野的缺失，负责感受弱光的视杆细胞的死亡，是非综合征性RP产生的第一步。RP患者外周视野和视力会迅速下降，双眼视力同时受损，最终会影响到中央视野、视敏度和彩色视觉。
遗传性的RP包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X染色体连锁遗传等，目前已知许多基因的突变会导致RP。自从1989年首例视紫红质（rhodopsin，RHO）基因突变被首次发现以来，已经确定了超过100个RHO基因突变位点。这些位点的突变占所有RP类型的15%，而占常染色体显性遗传RP的25%[6-7]。PRPF3、PRPF8、PRPF31和PAP1 4个pre-mRNA剪接相关因子的突变也会导致常染色体显性遗传RP。这些因子的表达十分广泛，但是仅在视网膜中导致疾病，可能是因为视网膜的光感受器细胞需要更多的蛋白质代谢参与[8]。目前已知至少45个基因与常染色体隐性遗传RP相关[6]，例如USH2A基因突变被发现会导致10%~15%伴随遗传性耳聋－色素性视网膜炎综合征（Usher Syndrome）[9-10]。目前发现X染色体连锁遗传RP与RPGR和RP2等6个基因相关[11-12]。
1.2 AMD的病理过程以及影响因子
AMD从病理上分为干性AMD和湿性AMD。干性AMD是由脉络膜和RPE萎缩、脉络膜增厚和黄斑萎缩引起的；湿性AMD是Bruch膜受损，脉络膜的毛细血管在Bruch处形成新生血管，引起视网膜下黄斑区反复渗液和出血并形成瘢痕，继而造成中心视觉丧失。正常RPE会在光感受器细胞和脉络膜之间形成紧密连接的单层细胞片层[13]，而光感受器细胞会不断老化并产生废弃物堆积在黄斑形成脉络膜玻璃膜疣，并引发慢性炎症[14]。玻璃膜疣能够进一步破坏RPE，致使光感受器细胞因得不到及时维护而受损，最终形成AMD（图1）。
图1 正常和退化的RPE细胞示意图 A：正常RPE细胞整齐地排列于视神经节和Bruch膜之间 B：退化的RPE细胞之间紧密连接缺失，视神经节退化并伴有玻璃膜疣的产生 RPE：视网膜色素上皮
年龄是AMD的危险因子之一，老龄化会通过表观遗传学修饰，如DNA的甲基化以及组蛋白乙酰化等促进基因的沉默，通常在大于60岁的人群中会出现细胞功能损伤并有致病风险[15]。线粒体是氧自由基反应的重要场所，线粒体基因的多态性，例如MT-ND2的多态性，与湿性AMD有关[16]。VEGF与湿性AMD中的血管生成有关，因此其抑制剂被临床用于治疗湿性AMD[17-18]。此外，受损的免疫系统调节尤其是补体系统可能对AMD的病程有影响[19]。一些补体的过度激活，会导致慢性炎症的发生[20]。由于免疫反应是导致AMD的重要因素，因此许多参与免疫反应的基因突变都是该疾病的重要风险因子，例如抑制炎症反应的补体因子H （complement factor H, CFH）的Tyr402His突变会导致AMD的产生[21]。目前已有一些与补体有关的治疗AMD的药物正在研究中，但是还没有被批准用于临床[22]。
2 干细胞用于退行性眼病的治疗现状
近些年，随着干细胞技术的快速发展和细胞工程在临床上的应用，细胞治疗已经逐渐成为一项应用前景广、治疗特异性好且安全、高效的、新的治疗手段。眼科疾病的细胞治疗由于存在所需细胞数量较低、移植技术成熟、存在免疫隔离等诸多优势，临床前及临床研究的开展更加充分。目前有望用于治疗退行性眼病的干细胞有多种类型[23]，例如间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、视网膜前体细胞（retinal progenitor cells，RPCs）、神经前体细胞（neural progenitor cells，NPCs）、嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）以及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）等[24-28]。MSCs有多种来源，包括骨髓来源、脂肪组织来源以及胎盘和脐带血来源，具有自我更新的能力并可以分化成为多种细胞类型，但缺点是MSCs来源的光感受器细胞存活率和迁移效率都很低。RPCs来源于胎儿或新生儿视网膜，在移植过程中可以迁移进入视网膜中，发育为多种细胞类型的视网膜细胞并具有一定功能，但是存在细胞来源的局限，且具有潜在免疫排斥反应[29]。NPCs来源于新生皮层，将其移植到光感受器细胞损伤的大鼠模型中能够长期维持视觉功能[30]，并且也已开展了临床试验。OECs是一类可以持续生长的胶质细胞，移植后可以清除堆积在视网膜下腔中的碎片，为细胞生长提供营养因子并降低Müller细胞的损伤反应[31]，但是移植细胞较难获得且难以直接应用。ESCs是来源于囊胚的内细胞团的具有多分化潜能的细胞，可以在分化为RPE以及光感受器细胞后用于移植[32]；iPSCs是由体外终末分化的体细胞重编程而来的，具有与ESC类似的分化潜能，将RP患者来源的iPSCs分化为视网膜前体细胞后移植可以得到具有功能的RPE和光感受器细胞[33-34]。美国FDA已批准多种细胞类型用于临床治疗退行性眼病的I/II期临床试验（表2）[23]。
视网膜退行性疾病最终受累的细胞是RPE和光感受器细胞。目前，RPE已经批准用于临床治疗研究，大量获得可供移植的RPE和光感受器细胞不仅对于视觉改善有极大的作用，而且可以降低未分化的干/祖细胞的致瘤风险。通过ESCs以及iPSCs体外定向诱导分化可以获得大量可供移植的细胞来源，因此下文将着重介绍RPE和光感受器细胞的临床治疗研究现状。
2.1针对退行性眼病中RPE细胞的干细胞疗法及其研究现状
由于RPE有保护和支持光感受器细胞的作用，并且在退行性眼病中较早受累，因此RPE移植是目前治疗退行性眼病的重要临床方案之一，人ESCs以及iPSCs来源的RPE细胞移植治疗都已开展了临床试验[27-28]。细胞移植的方法主要有2种：一种是注射悬浮的细胞；另一种是移植带膜或不带膜支撑的RPE单层细胞。实验研究表明，在免疫缺陷小鼠中进行RPE细胞长期移植不会产生肿瘤[28]。在免疫缺陷的大鼠视网膜下腔移植的人ESCs来源RPE单层细胞存活时间超过12个月且无肿瘤形成[35]。首例ESCs来源的细胞治疗在人体的临床疗效试验中，也没有发现肿瘤的迹象[36]；对18例接受细胞治疗患者的跟踪研究也未发现严重的安全问题[28,37]。同样，iPSCs来源的RPE细胞层的移植也未发现肿瘤形成免疫排斥[27]。此外，Choudhary等[38]开发的基于CD59的流式分选方案能有效净化干细胞来源的RPE并去除残余干细胞，进一步增加了细胞替代疗法的安全性。美国FDA已经批准ESCs分化得到的RPE治疗黄斑变性的临床试验[23,36]。在此研究的基础上，韩国也开展了ESCs分化得到的RPE治疗AMD的临床试验[39]。
在细胞替代疗法中，安全、高效的细胞来源异常重要。McGill等[40]报道了将异种级人胚胎干细胞（OpRegen）衍生的RPE移植到RCS大鼠视网膜下。OpRegen RPE细胞不仅能存活和改善视觉功能，还能长期保护视锥和视杆细胞。此外，患者自身来源的iPS细胞分化后移植可以降低免疫排斥和异体细胞导致的基因多样性的风险，有望用于基因治疗。2013年，1例日本女性AMD患者接受了全球首例自体来源的RPE移植[41]。随着组织工程技术的发展，细胞和仿Bruch膜的共同移植以及三维的人胚胎干细胞来源的RPE（3D-RPE）也逐渐进入人们的视野，为细胞疗法治疗退行性眼病提供了新的治疗思路和细胞来源[42]。
综上所述，在针对退行性眼病中RPE细胞的干细胞疗法的临床治疗中，安全性问题仍是关注的第一热点。关于如何使移植的干细胞不形成肿瘤和发生免疫排斥，近年来取得了较大进展，细胞替代疗法的安全性日益提高。此外，细胞来源将成为未来干细胞疗法的关注焦点，目前人ESCs、iPSCs和自身来源的细胞都在干细胞治疗中表现出巨大的潜力。总之，针对退行性眼病中RPE细胞的干细胞疗法正在不断完善，其在临床上的应用也日益广泛和安全。
2.2针对退行性眼病中光感受器细胞的干细胞疗法的治疗和研究现状
退行性眼病，如RP和AMD会导致光感受器细胞损失，继而造成视力障碍。因此，RPE移植需要在光感受器细胞受损早期尚能可逆修复时进行，或者移植进入的RPE细胞含有可分化成为光感受器细胞的前体细胞时，才能更好地恢复视觉功能。有研究表明，基于ESCs或iPSCs的细胞替代疗法和CRISPR/Cas基因编辑技术可以作为研究和治疗RP的新手段[43-44]。更有团队提出了一种将人骨髓MSCs与人RPCs进行联合移植治疗RP的方案，在RCS大鼠模型中的实验表明联合移植的光感受器细胞的分化率高于单一移植[45]。与治疗RP的思路相同，基于ESCs或iPSCs的细胞疗法在治疗AMD上也具有巨大潜力[46-47]。在近几年中，不同团队分别研究了小鼠ESCs来源的可追踪和可移植的光感受器细胞的生成和人ESCs来源的视网膜组织在2种视网膜退化的灵长类模型中移植的可行性[48-49]。又有研究表明，将发育中的视杆细胞移植入Crx基因敲除小鼠的退化视网膜中时，其表现出的神经活动与原生的光感受器细胞类似[50]。因此，体外iPSCs来源的视杆细胞可以为细胞替代疗法提供一个新的细胞来源。此外，Barnea-Cramer等[51]将人iPSCs来源的光感受器细胞前体移植入视网膜变性晚期的小鼠中，并成功分化为光感受器细胞且与宿主细胞的视神经相连，通过视觉行为实验发现被治疗的动物的视觉功能得到了部分恢复，且功能改善程度与移植细胞的数量呈正相关。由此可见利用ESCs或者iPSCs分化成的光感受器细胞进行移植可以更为直接地达到恢复视力的目的。
为了使移植后的干细胞能有效分化为具有功能的光感受器细胞，干细胞的来源十分重要。Kruczek等[52]发现小鼠胚胎干细胞来源的视锥细胞在终末期视网膜变性小鼠模型中表现出了很好的生产和成熟能力。Royall等[53]也提出了一种新的培养方案可以将猪虹膜组织中一独特的神经干/祖细胞分化为神经元和视杆样细胞。鉴于人类与家猪在进化上的相似性，这一方法在人类疾病建模和人眼干细胞的研究中具有重要价值。研究表明，RPE细胞是一个能生成新光感受器细胞的便捷来源[55-55]。此外，来源于患者自体细胞的iPSCs在干细胞治疗中也有很大的潜力。Wiley等[56]在cGMP（current good manufacture practices）条件下发展出了一种用来源于患者皮肤细胞的iPSCs制造光感受器细胞前体的临床适用性方法，并且没有发现异常增生和肿瘤的形成。但是患者来源的iPSCs仍然携带有致病基因，因此有团队对此展开研究，发现可以利用CRISPR/Cas基因编辑技术来纠正来自患者iPSCs的致病突变[57]。这极大地提高了来源于患者自体细胞的干细胞疗法的临床适用性。
总体来说，退行性眼病中光感受器细胞的干细胞疗法关键在于在患者体内移植干细胞能成功分化为具有功能的光感受器细胞。在这一方面，虽然在动物实验中取得了较多成果，但是在未来仍需要更多的临床验证结果；同时我们仍需要探寻能更有效地分为化具有功能的光感受器细胞的干细胞来源，并增强其临床适用性。
3问题与展望
众多动物实验及部分临床试验证明干细胞移植对退行性眼病治疗具有巨大潜力，但由于不同干细胞本身存在基因组或者表观遗传学改变，例如基因突变、基因拷贝数改变以及重编程过程中DNA甲基化水平的异常改变等[58]，均可能导致对干细胞的分化及分化后细胞功能和行为产生背景性影响，导致不同细胞系来源的视网膜细胞本身就可能存在差异性，因此干细胞来源的视网膜细胞移植的远期有效性和安全性依然有待进一步深入评估[59]。除了本文提到的干细胞来源的视网膜细胞移植，神经干细胞移植、MSCs移植等其他类型的细胞移植临床试验也在开展中，而异体细胞移植的首要问题，即移植免疫排斥反应仍是细胞治疗的巨大挑战。为了解决上述问题，Nakatsuji等[60]尝试建立多能性细胞库用以匹配人白细胞抗原，以此减少免疫反应。另外，异体移植带来的基因组改变仍然是一个潜在的问题，因为其中的自体细胞重编程技术中仍无法精细控制，需要进一步研究。2016年，来自中国中山大学、四川大学、广州市康瑞生物科技有限公司和美国加州大学圣地亚哥分校、德州大学西南医学中心、哈佛大学医学院的研究人员开发出一种新的再生医学方法，通过改良的白内障手术技术，在移除先天性白内障婴儿晶状体的同时，保留并刺激自身晶状体干细胞成功再生出功能性的晶状体。该方法通过激活患者自身的内源性干细胞进行组织再生修复，相较于通过ESCs/iPSCs体外分化出功能细胞或组织再移植到患者体内，再生组织的结构和功能更完善，且有效避免了免疫排斥和体外多重诱导带来的潜在变异问题[61]。虽然有局限性，视网膜细胞的移植治疗依然给退行性眼病的治疗带来了希望，并且随着实验技术的不断优化，利用ESCs更高效地分化为各种类型的视网膜功能细胞也将会为退行性眼病的治疗提供更多的细胞来源。此外，现今发展的CRISPR技术可以高效特异地修复突变基因，对于退行性眼病的个性化治疗也将产生十分积极的作用[62-65]。随着科学技术的发展，越来越多的技术可以用于退行性眼病的治疗，并且也会更为安全、有效。 |
