作者：吕菊玲。2016年10月。
中华实验眼科杂志, 2016,34(10): 952-956. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.019。
摘要
目前，全世界已有31项眼部疾病基因治疗临床试验被批准，多数仍处于研究阶段。Leber先天性黑朦(LCA)目前已开展Ⅲ期临床试验，随访时间最长6年；无脉络膜症多中心的临床试验也取得了积极效果；视网膜色素变性(RP)已开展基因治疗Ⅰ期临床试验；年龄相关性黄斑变性(AMD)基因治疗的Ⅰ期临床试验结果令人鼓舞；青光眼基因治疗中使用RNA干扰技术和优化的偶联表面活性磷脂纳米微粒也取得了良好效果。就LCA、RP、无脉络膜症、AMD和青光眼基因治疗的一些实验室及临床研究进展，包括眼部基因治疗方法、各种基因载体和常用的动物模型等进行综述。病毒载体已广泛应用于眼部疾病的基因治疗中，一些与免疫排斥和基因突变相关的潜在性风险以及个体反应的差异性促使人们去探索更安全、高效的方法。基因编辑技术的出现，必将对眼部疾病的基因治疗领域产生深远影响。
引用本文: 吕菊玲, 邢怡桥, 沈吟. 眼部疾病的基因治疗进展 [J]. 中华实验眼科杂志,2016,34( 10 ): 952-956. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2016.10.019 正文作者信息基金 3 关键词 5 主题词 0English Abstract评论阅读 36 引用 0相关资源视频 0 论文 0 大综述 0以下内容和版式版权归属中华医学会，未经授权不得转载 × 基因治疗指利用DNA重组技术将目的基因转染至靶细胞内，包括基因改建、修饰和置换，干预异常基因表达，纠正遗传病的基因缺陷而达到治疗疾病的目的。眼部视网膜变性疾病已成为当今世界上不可逆盲的主要原因，其视功能损害的病理基础是视网膜神经元的不可逆性损伤，如视网膜色素变性(retinitis pigmmentosa，RP)、Leber先天性黑朦(Leber congenital amaurosis，LCA)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)及青光眼等，目前临床上仍缺少有效的治疗手段。随着分子生物学水平、基因诊断和治疗水平的提高以及基因测序技术的广泛应用，人类对疾病本质的认识更加深刻。就LCA、RP、无脉络膜症和AMD、青光眼基因治疗的一些实验室及临床研究进展进行综述。
1 眼部疾病基因治疗的优势
眼球特殊的生理及解剖学特点使之成为基因治疗的理想器官。(1)眼部遗传病多为单基因病，治疗相对简单。(2)眼球是一相对独立的器官，体积较小，所需基因或细胞的数量相对较少。(3)眼球属于相对免疫赦免器官，由视网膜血管和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)共同组成血－视网膜屏障，外来药物、基因和细胞较少引起免疫应答。(4)可以实现双眼间的自身对照。(5)眼的屈光透明性使得我们能够在可视情况下进行眼部操作。(6)可借助裂隙灯显微镜、眼部超声检查仪、眼底照相仪、OCT等直接观察眼部各组织的结构，也可应用视觉电生理、荧光素眼底血管造影等评价视网膜神经细胞和视功能改变。
2 眼部疾病基因治疗的方法
2.1 常规给药
常规给药方法包括局部点药、球周注射、前房注射、玻璃体腔注射、视网膜下注射和脉络膜上腔注射给药，每种给药方式各有利弊。由于解剖位置的不同，视网膜下注射给药主要转染RPE细胞和光感受器细胞；玻璃体腔注射主要转染视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)。球周给药包括球侧注射、球后注射、后巩膜下注射、球筋膜囊下注射和结膜下注射。球结膜下注射适于给药量较大的药物，可重复性好。
2.2 基因导入系统
理想的基因导入系统是通过非侵入或低侵入性方法给药，靶组织能够有效、广泛地吸收，且无异常基因表达。基因导入系统主要包括以下几种导入方式：(1)病毒载体 病毒载体在基因导入系统中最常用，主要包括腺病毒、腺相关病毒载体(adeno-associated viruses，AAVs)、慢病毒载体和逆转录病毒载体。AAVs转染效率依赖于血清型和衣壳蛋白。衣壳蛋白可以在不同的血清型之间交换形成AAVs重组体。AAV2/5和AAV2/8转染光感受器细胞效率最高，以视杆细胞为主。AAVs转染效率在不同种属和不同组织中各不相同，在活体和离体组织中也不尽相同，如在角膜纤维细胞中，AAV6的转染效率是AAV2/8和AAV2/9的30～50倍[2]；在活体小鼠角膜和离体人角膜的转染效率AAV2/9>AAV2/8>AAV2/6[3]。病毒载体能够瞬时或长期稳定高表达外源基因，通过抗性筛选建立稳定表达的细胞系，但同时也存在一定的免疫原性和靶细胞毒性，不能通过人体代谢；(2)RNA干扰技术 如小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNAs)缓释系统可以提高基因导入效率、减少注射次数；(3)非病毒载体 非病毒载体分为物理方法和化学方法。物理方法主要包括离子导入法、电穿孔转染、基因枪法和细胞核转染，该方法转染效率有限；化学方法主要包括脂质类载体和聚合物载体。相较于病毒载体，非病毒载体毒性较低且代谢性较好，可针对病变部位进行个体化转染[4]。
2.3 基因表达元件
基因表达元件包括：(1)组织特异性启动子 如胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的靶细胞是视网膜Müller细胞[5]；(2)可诱导性调控序列 包括环境诱导系统和药物诱导系统，即启动子对特异性环境信号或药物作出反应，如糖尿病视网膜病变和AMD患者在正常氧含量条件下低氧反应元件不起作用，需设计某种载体诱导低氧区域基因表达来对抗视网膜新生血管[5,6]；利用多西环素可诱导表达系统治疗视网膜新生血管、糖皮质激素反应元件治疗青光眼[7,8]。
3 眼部疾病基因治疗的现状
眼部疾病的基因治疗还处于起始阶段，还需很长一段时间的过渡期实现从动物实验到人体临床试验。目前，眼部疾病的基因治疗已经在RP、LCA、AMD和青光眼等遗传性疾病研究中取得了一些进展。
3.1 眼部罕见疾病的基因治疗
3.1.1 LCA
LCA的基础与临床治疗效果显著，是现今眼科基因治疗的典范。到目前为止，已经发现了14个与LCA相关的致病基因，其中RPE65基因在RPE细胞中特异性表达，其编码的蛋白质参与光信号物质的代谢循环[9]。自2008年以来，在LCA患者中实行基因治疗的临床试验相继开展，部分患者视功能明显改善。Boye等[10]在LCA1小鼠模型上利用AAV载体进行相关基因治疗，结果显示模型鼠视网膜功能恢复且维持6个月以上。
Burnight等[11]利用慢病毒载体将CEP290导入LCA患者体外培养的CEP290突变细胞中，可改善患者细胞纤毛形成缺陷。Bainbridge等[12]对接受临床试验Ⅰ～Ⅱ期(3年)rAAV2/2基因治疗的12例LCA患者进行研究发现，患者视敏度明显提高且程度不一，其中6例视敏度峰值出现在基因治疗后6～12个月，随后开始下降；3例出现眼内炎；2例视力减退明显；所有患者中心视网膜厚度变薄；同时研究犬载体剂量与视功能、视网膜电图(electroretinogram，ERG)的关系，发现低载体剂量只能改善视觉引导的相关行为，而高载体剂量引起的视功能改善可以通过ERG检测发现。这些结果表明，rAAV2/2 RPE65可以暂时性地改善视敏度，但载体剂量存在种属差异。Jacobson等[13]进行的LCA临床试验随访5～6年结果显示，3例患者治疗后6个月时视敏度均提高，视力改善最长能够维持3年，其中1例患者治疗后1～3年视敏度明显增加，之后开始下降，但视网膜光感受器细胞数量丢失率同治疗前，说明基因治疗后早期视力改善和后期减退均存在快相期和慢相期，与同时伴有光感受器细胞变性有关。
3.1.2 无脉络膜症
无脉络膜症是性染色体连锁隐性遗传性眼病，发病率为1/50 000，多为男性，主要由于编码REP1的CHM基因突变导致。该病主要病理特征为脉络膜、RPE层和光感受器细胞的进行性萎缩[14]。MacLaren等[15]对6例无脉络膜患者黄斑下注射AAV.REP1来评估基因治疗的疗效，结果显示所有患者治疗后视力与治疗前相比均有提高，暗适应微视野均有改善，治疗6个月后的黄斑视敏度与所治疗区的载体剂量有关。该项临床试验说明，基因治疗后视杆细胞和视锥细胞功能恢复，克服了视网膜脱离所产生的负作用，为进一步研究视网膜疾病基因治疗的临床应用提供了证据支持。
3.1.3 RP
全世界RP的发病率为1/4 000，中国RP的发病率高达1/1 000[15,16]，其相关致病基因繁多。目前，RP已开展基因治疗Ⅰ期临床试验，3例患者接受了视网膜下注射携带特异RPE启动子的AAV2，无不良反应发生[17]。Choi等[18]在Rlbp1－/－小鼠视网膜下注射scAAV8-pRLBP1-hRLBP1(包含AAV8的衣壳和自身互补基因组)能提高该小鼠的暗适应率。Guo等[19]将HDAC4通过质粒转染rd1小鼠视网膜，发现光感受器细胞存活时间延长。RP的产生机制包括细胞自主机制(即光感受器表达基因的突变)和非细胞自主机制(即炎症的影响)。Zhao等[20]通过基因敲除的方法消除小胶质细胞后，视杆细胞变性得到改善。 |
