常染色体隐性遗传与散发型视网膜色素变性基因筛查与临床表型分析（Eys）

常染色体隐性遗传与散发型视网膜色素变性基因筛查与临床表型分析
韩菲【摘要】：目的确定国人常染色体隐性遗传视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa, ARRP)及散发型视网膜色素变性(sporadic retinitis pigmentosa, SRP)的致病基因及突变形式；分析ARRP/SRP患者的临床特征；探索基因型与临床表型的关系。方法收集2009-2012年在北京协和医院眼科就诊并确诊为ARRP/SRP的患者。1.临床研究：记录病史及家族史,行眼科一般检查(视力、屈光度、眼前节及散瞳眼底检查)及特殊检查(眼底照相、视野、视网膜电图(electroretinogram, ERG)及相干光断层扫描(optical coherence tomography,OCT))检查。2.遗传学研究：采取患者静脉血5-8ml,同时收集同期正常人作为对照,提取外周血DNA。将部分患者的DNA送交华大基因研究中心,对致病基因行外显子捕获,随后应用Hiseq2000第二代高通量测序平台测序,得到可疑突变,应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,

CR)扩增并直接测序加以验证。以上述结果为指导,在收集的ARRP/SRP患者中,对RHO、MERTK、

DE6B、CERKL、RP
1、USH2A、 EYS基因的相应外显子及外显子-内含子接头处进行PCR扩增,直接测序确定致病突变。发现DNA序列改变后,查询文献及遗传学数据库,排除其为已知正常多态位点的可能,并明确是否为已报道突变。若为新发突变,对至少100个(200条染色体)无血缘关系的正常人进行该位点的扩增、测序,以排除未知群体多态性的可能。结果1.共收集110例ARRP/SRP患者,ARRP21例,SRP89例；108例为双眼发病,2例单眼发病。72.5%的患者在20岁前出现夜盲,就诊时视力介于无光感-1.5,平均约0.2。36.8%的患眼合并后囊下白内障。眼底表现：视乳头蜡黄,视网膜血管变细,视网膜不同程度萎缩；黄斑形态可大致正常、可萎缩；视网膜可见不规则色素团块/骨细胞样/椒盐样/灰白小颗粒的色素沉着,主要分布于中周部及周围视网膜。OCT：中心凹神经上皮薄变,IS/OS层信号缺失是最主要的病变特征,中心凹神经上皮平均厚度为125.15±39.68μm,明显低于正常人群(P0.05)；27.2%的患眼伴发视网膜/黄斑前膜；部分患者合并神经上皮水肿及黄斑囊腔样改变。ERG：98.5%的患眼表现为视杆反应熄灭型,34.1%为视锥反应熄灭型。2.共明确了18例患者的致病基因：MERTK基因11例、PDE6B基因3例、USH2A基因、CERKL基因、RP1基因、EYS基因各1例。17例患者存在单一杂合突变(MERTK基因8例,PDE6B基因1例,USH2A基因2例,EYS基因3例,RHO基因3例)。①MERTK基因：突变率6.9%。共发现18种致病突变,1种错义突变,1种无义突变,6种移码突变,3种已报道,其中225delA, Gly76Glu, fsX3这一移码突变在4例患者6个DNA单倍体中出现,突变率较高。2例单眼发病的RP患者均存在MERTK基因突变。②PDE6B基因：发现5种突变,3种错义突变,2种移码突变,均为未报突变。③USH2A基因：共发现4种突变,2种错义突变,移码突变、剪切突变各一种,3种为未报突变。④EYS基因：共发现5种突变,2种错义突变,无义突变、移码突变各一种,均未报道。⑤RP1基因：共发现2种移码突变,未报道。⑥CERKL基因：一种移码突变,未报道。⑦RHO基因：一种错义突变,未报道。结论1.临床特征：ARRP/SRP多于少年起病。白内障是常见的眼前节异常；视网膜色素上皮迁移是RP的普遍体征；黄斑损害常见,以神经上皮薄变为主,视网膜前可见胶质增生形成视网膜/黄斑前膜；ERG是重要的视功能检查,视杆反应呈熄灭型是其主要电生理特征。2.遗传学：确定了18例患者的致病基因,发现了位于7个致病基因内的36种突变。MERTK基因突变率较高(6.9%),与欧美人群存在较大差异,单眼发病的RP可能与MERTK基因突变相关。3.RP具有高度的临床及遗传异质性,相同的临床表型可由多种基因突变所致,同一种基因突变临床表型可有

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圣洁雪域发表于 2014-5-4 18:34 | 只看该作者

２００８年发现的ＥＹＳ基因是人类最大的基因之一，同时也是到目前为止发现最大的与眼相关的基因，其大小超过２Ｍｈｌ，，其功能与光感受器结构的发生有关［３３“Ｊ。目前常染色体隐性遗传ＲＰ的最新研究进展：ＲＢＰ３基因的突变很少导致常染色体隐性遗传ｌｉｐ，但是目前在４个常染色体隐性遗传ＲＰ患者的同胞中，也发现了１个ＲＢＰ３基因纯合子的错义突变现象哺１；同时还发现ＣＥＲＫＬ基因能够保护由氧化损伤引起的光感受器细胞凋亡ｍｏ。
３．ｘ．连锁遗传ＲＰ：目前已经能够检测到６个与ｘ一连锁遗传ＲＰ相关的致病基因，其中较多见的是：ＲＰＧＲ（７４．２％）。ＲＰ２（１５．１％），他们约占ｘ－连锁遗传ＲＰ的８９．３％。其他导致ｘ－连锁遗传ｆｕＰ的相关致病基因还包括ＲＰ６，ＲＦ２３，ＲＰ２４等，但是他们在ｘ－连锁遗传ＲＰ中的突变率尚不清楚一“…。
连锁分析资料表明约７４．２％的ｘ－连锁遗传ＲＰ是由ＲＰＧＲ基因突变引起ｍＪ，但到目前为止其相关蛋白在视网膜内外的功能尚不清楚。由于绝大部分ＲＰＧＲ基因突变仅仅是在单独家系中发现，因此很难判断其表现型与基因型之间的相关性。总体而言，携带ＲＰＧＲ基因突变患者的临床症状与携带其他ｌｉｐ致病基因突变的患者相比，视野更小、视网膜电图检测其振幅降低更严重。２００１年Ｚｈａｏ等¨副在ｘ．连锁遗传ＲＰ患者的ＲＰＧＲ基因上发现了一个新的２８ｂｐ缺失突变。２００７年ｃｈａＩｌｇ等在我国一个４代ｘ－连锁遗传ＲＰ家系中发现１个ＲＰＧＲ基因的新昏ＯＲＦｌ５＋１１６６ｄｅｌＡ位点突变，这是引起ｘ－连锁遗传ＲＰ的直接原因∽Ｊ。２００８年夏小平等Ⅲｏ在一个中国ＲＰ家系患者的ＲＰ３基因上发现基因外显子ＯＲＦｌ５＋１３３９ｄｅｌＡ位点突变。Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ等Ｈｕ对来自德国、丹麦、爱尔兰及瑞士的１４１个ｘ．连锁遗传ＲＰ家系进行研究，发现４６个家系有ＲＰＧＲ和ＲＰ２基因突变，其中１７个基因属于新突变，３５％的基因突变发生在ＯＦＲｌ５位点，最常见的２个基因突变发生在３
７末端。在鳓外显子
ＯＦＲｌ５中，发现８个新的基因突变和１４个已知的基因突变。所有的基因突变均导致开放阅读框的断裂。最近采用双向荧光序列分析法进行研究，发现位于ＲＰＧＲ基因外显子５的完全外显新突变，而且其发病情况与性别状态分离，发病的女性患者都伴有高度近视ｍ】。另外，约１５．１％的ｘ－连锁遗传ＲＰ患者由ＲＰ２基因突变引起惮’，该基因编码一个含３５０个氨基酸的蛋白，与人辅助因子Ｃ有同源性，这可能与微管蛋白折叠过程有关。在日本的５个ｘ－连锁遗传ＲＰ家
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生堡腿登盘壶垫！Ｑ生呈旦筮堑鲞筮２期垦塾垫』虫幽趔：坠虹垫！Ｑ：！吐箜：壁垒至
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系中，有３个家系出现ＯＲＦｌ５基因突变，１个家系出现ＲＦ２基因突变［４３］。
（－－）Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎基因研究进展
Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎是最严重的遗传性视网膜病变，占遗传性视网膜疾病的５％，患病率约为１／３００００—１／８１０００，是导致儿童先天性双眼盲目的主要遗传性眼病（占１０％一２０％），具有临床表现多样性与遗传异质性的特点ⅢＪ。其临床特征为出生时或出生不久（多数６个月内）即出现视力低下或丧失、眼球震颤、黑嚎性瞳孔，早期眼底可无异常表现或有色素沉着，晚期眼底有椒盐样色素和骨细胞样色素沉着。检测结果异常等。一般认为Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎为常染色体隐性遗传，也有少数文献报道为常染色体显性遗传ⅢＪ。自１９９６年以来，相关研究相继发现１４个与Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎相关的致病基因：ＡＩＰＬＩ，ＣＲＢｌ，ＣＲＸ，ＧＵＣＹ２Ｄ，ＬＲＡＴ，ＴＵＬＰｌ，因ｍＪ。这些基冈在视网膜中显著表达，其涉及视网膜光信号向电信号的传导过程（ＧＵＣＹ２Ｄ）、视网膜内维生素Ａ在光在眼科遗传性视网膜疾病的基因治疗方面，首先在（三）先天性静止性夜盲基因研究进展
先天性静止性夜盲是一种少见的遗传性视网膜病变。染色体显性遗传的先天性静止性夜盲患者的编码视紫红质基因（ＲＨＯ基因）上发生Ａｌａ２９２Ｇｌｕ位点突变。１９９７年Ｆｉｓｈｅｒ等Ⅲｏ报道钙通道ａｌ亚基与性连锁不完全性先天性静止性夜盲密切相关。２０００年Ｂｅｃｈ－Ｈａｎｓｅｎ等ｍ１对ＮＹＸ基因与性连锁完全性先天性静止性夜盲的相关性进行研究，发现３个基因５个突变位点与常染色体显性遗传的先天性静止性夜盲有关，３个基因与常染色体隐性遗传的先天性静止性夜盲相关，２个基因与性连锁先天性静止性夜盲有关。这些发现的突变基因推进了对先天性静止性夜盲发病机制和发病部位的认识进程。２００６年Ｘｉａｏ等净。在我国先天性静止性夜盲患者的ＮＹＸ基因上发现２个新的突变位点。ＲＩｔＯ，ＰＤＥ６８和ＧＮＡＴｌ基因突变将导致常染色体显性遗传的先天性静止性夜盲。Ｚｅｉｔｚ等”刊在１个瑞士大家系中发现了ＲＩｔＯ基因的第４个突变位点，该突变与视蛋白的光传导有关。到目前为止，至少已经发现ＲｔｔＯ，ＰＤＥ６Ｂ，ＧＮＡＴｌ，ＣＡＢＰ４，ＧＲＭ６，ＳＡＧ，ＮＹＸ，ＣＡＣＮＡｌＦ，ＣＡＣＮＡ２Ｄ等９个与先天性静止性夜盲相关的致病基因。
（四）Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良的基因研究进展
Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良又称Ｂｅｓｔ黄斑营养不良或Ｂｅｓｔ病，是一种不规则的常染色体显性遗传性疾病，发病率低于１／１００００，也有一些散发病例。其典型的临床特征是在青少年时期双眼黄斑部视网膜出现卵黄状脂质样沉积物，而视力很少受影响。近年来的研究结果表明，卵黄样黄斑营养不良基因（ＶＭＤ２）与Ｖｉｔｅｌｌｆｆｏｒｍ黄斑营养不良有关。ＶＭＤ２基因被认为是与Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良的相关基因，近年来将ＶＭＤ２基因定位于１ｌｑｌ３位点，约为９８０
ｂｐ×１０３
ｂｐ大
小，包含１１个外显子［ｓｓ棚Ｊ。目前认为ＶＭＤ２基因突变可导致ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ蛋白中氨基酸序列的改变，从而造成视网膜色素上皮细胞膜上氯离子通道功能障碍，引起Ｂｅｓｔ病旧Ｊ。我国侯乒等【６ｕ研究了ｌＯ个Ｂｅｓｔ病家系，发现９人的ＶＭＤ２基因外显子２的第２２３位点碱基Ｃ—Ｔ颠换，其中６人的眼底和眼电生理检查结果证实其为Ｂｅｓｔ病患者，２人为该突变的纯合子；另外有３个年轻成员虽然携带ＶＭＤ２基因突变，临床上仅表现为视网膜电图的异常。在正常对照者中未发现上述突变。并进一步确认Ｂｅｓｔ病家系中Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良的表现型与其基因型密切相关，ＶＭＤ２基因突变是该家系的致病原因。“等旧１在我国Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良患者的ＶＭＤ２基因中发现了一个新的突变，即ＣＡ２７Ｇ。侯乒等旧１在我国３例散发的Ｂｅｓｔ病患者中分别检测出３个碱基的改变（４３１Ｇ＞Ａ，７６３Ｃ＞Ｔ，８８９Ｃ＞Ａ），其导致编码氨基酸发生错义突变（Ｓｅｒｉ４４Ａｓｈ，Ａｒ９２５５Ｔｒｐ，Ｐ１０２９７Ｔｈｒ），而在对照组中未检测出这３个位点变化，表现为患者和正常对照组存在共分离现象，进一步确定这３个位点的突变为新发现的ＶＭＤ２位点突变。Ｍａｒｅｈａｎｔ等Ⅲｏ在Ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ黄斑营养不良患者中发现了６个ＶＭＤ２基因突变，均定位于４、６，８外显子，其中Ｑ２９３Ｈ突变非常严重，能够以显性负相的方式抑制野生型ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ－１通道的功能。Ｓｏｄｉ等旧３在意大利５个Ｂｅｓｔ病的家系中，发现Ｒ２１８Ｇ和Ｒ２５Ｗ位点新突变，前者的
视网膜电图检测无波形显示或波幅严霞减低，视觉诱发电位ＭＥＲＴＫ，ＲＰＥ６５，ＲＰＧＲＩＰＩ，ＣＥＰ２９０，ＲＤＨｌ２，ＬＣＡ５等ｐ“。目前最新发现的Ｎｔｐ基因也可能是Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎的致病基信号中的代谢循环（ｅｄ＇９６５）、视网膜光感受器细胞的分化和发育（Ｃｇｇ）、蛋白转运和正常分布（ＡＩＰＬＩ、ＲＰＧＲＩＰｌ）及光感受器结构形态发育（ＣＲＢＩ）等方面的重要功能。其中ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＰＥ６５及ＭＰＬｌ等３个基因都是以纯合突变导致
Ｌｅｂｅｒ先天性黑朦；而ｃ麟基冈杂合与纯合突变均可以导致
Ｌｅｂｅｒ先天性黑朦，但大多为杂合突变。２００１年Ｚｈａｎｇ等Ｈ¨扫描Ｌｅｂｅｒ先天性黑噱患者的ＣＲＹ（基因，发现Ａ１８１Ｄ１ｂｐ突变位点是导致我国Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎发病的原因。ＧＵＣＹ２Ｄ编码光感受器特异环化酶，该基因突变会使鸟苷三磷酸向鸟
苷环腺苷磷酸依赖性蛋白激酶转化受阻。Ｐｅｒｒａｕｈ等ｍｏ研
究了１５个Ｌｅｂｅｒ先天性黑嚎家系，其中８个家系由ＧＵＣＹ２Ｄ基因突变所致。ＲＰＥ６５是迄今发现的惟一的视网膜色素上皮细胞特异表达的致病基因，所编码的蛋白质功能是维持视网膜色素再循环，也是Ｌｅｂｅｒ先天性黑噱患者常见的致病基
斟４９１。
Ｌｅｉ吣ｒ先天性黑朦患者中取得了突破性进展。２００８年美国和英国的眼科专家分别成功为９位Ｌｅｂｅｒ先天性黑喙患者施行了基因治疗，使眼科基因治疗真正从实验室走向临床，开启了眼科遗传性疾病基因治疗的新时代唧“。
以先天性非进行性夜盲为临床特点，暗适应和视网膜电图检查发生特征性改变。按遗传方式分类，先天性静止性夜盲通常分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、ｘ一连锁隐性遗传，共３种。不同遗传方式的先天性静止性夜盲患者临床表现有一定差异，但均以视网膜杆体系统严重受损为表现特征。近年来，随着分子遗传学的发展，对先天性静止性夜盲
的研究逐渐转至基因水平。１９９３年Ｄｒｍ等口３１首先发现常
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功能可能是激活ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ蛋白的活性，有可能导致脉络膜新生血管形成；而后者能够导致多灶性卵黄状脂质样沉积物。目前的研究证实ＶＭＤ２基因突变能够引起多灶性的卵黄状变性和基因异质性的视网膜遗传病惭１。我国欧阳艳玲等旧刊采用基因序列分析法进行研究，证实ＶＭＤ２基因第３０１密码子第３个碱基呈杂合子点突变。

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圣洁雪域发表于 2014-5-4 19:05 | 只看该作者

英国知名医学杂志《柳叶刀》2009年11月刊曾报道说，美国宾州大学和费城儿童医院等机构合作，成功地为一名叫做科里·哈斯的8岁男孩进行了实验性基因疗法。哈斯患有“利伯氏先天性黑蒙症”，这是一种由一个叫做RPE65的基因突变导致的遗传性视网膜眼疾。RPE65基因所制造的蛋白能将维生素A转化为吸收光线的视网膜色素，如果缺乏这种基因或者基因发生突变而无法发挥正常功能，人即便生下来不是盲人，也会由于储存的视网膜色素消耗殆尽而逐渐失明。

在为哈斯治疗时，研究人员试图创建一个功能基因，来取代视网膜上错误的基因。他们先将矫正性DNA（即正常的RPE65基因）导入一个经过处理的、无害的腺相关病毒（AAV），以之作为载体，再用一根细针把它注射到哈斯眼睛里。然后，由病毒带着新基因进入光敏感细胞的细胞核，将自己的DNA插入到细胞的DNA中，取代有缺陷的基因。接着，那些新生成的健康蛋白将维生素A转化为视网膜色素。这样一来，眼睛的功能就正常了。

这一结果令医学界深受鼓舞，因为它不仅能够促进基因疗法的发展，而且意味着可以利用基因疗法治疗更多的普通视网膜疾病。

期待更多奇迹发生

虽然基因疗法早已进入临床试验阶段，但目前在治疗大多数遗传疾病上，并没有取得太大的进展。换句话说，现有的治疗能力远远落后于诊断水平。此外，基因疗法还有许多未知因素乃至危险因素，也引起了争议。比如，担心携带新基因的载体被随机整合到基因组中存在诱发癌症的潜在风险、胚胎基因疗法可能会扩大对人类的生物结构的人为改变等等，而人们对操控人类基因的危险性及被滥用的可能性也普遍存有恐惧心理。

此外，虽然基因治疗在一定程度上是从根儿上解决问题，但并不意味着能包治百病。因为有的疾病不完全是由基因决定的，还跟心理、环境和生活方式等因素有关。

有报道说，从上世纪90年代开始，美国即进行临床基因疗法。1999年，患有先天OTCD遗传病的美国男孩杰西·吉尔辛格在接受基因治疗4天以后去世，从而引发了大众对基因疗法的质疑，多项基因疗法的研究项目因此被叫停。但是，后来的调查表明，杰西主要是因其体内对载体腺病毒产生过度免疫排斥反应而死亡。

美国霍华德·休斯医学研究所教授凯瑟琳·海伊认为，未来基因疗法将变成治疗基因疾病的一种选择。当初，单克隆抗体发展成常规疗法用了30年时间，骨髓移植也差不多花了这么长时间才变成标准的治疗方式。重要的是应该意识到，发展一种全新的治疗方式虽然看起来很慢，但每一步都会离目标更近。

DNA双螺旋结构的发现者之一詹姆斯·沃森在他新近出版的一部著作中断言：“看来基因疗法似乎还要很长的时间，才能创造基因革命开始时所预见的奇迹。”尽管如此，他仍旧认为，“这个技术破解遗传疾病宿命的潜力实在很大，医学界绝不能放弃它。”

成功的基因疗法，有潜力校正导致很多疾病产生的根本原因，因此一直被视为生物医学研究的“圣杯”，甚至，有可能像半个多世纪以前的抗生素开发那样，引发一场深刻的医学革命。

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基因疗法“亮点手术”

2008年4月，《新英格兰医学杂志》网络版报道说，英国一名患先天视力障碍的青年接受世界首例视网膜基因注射疗法，经过近一年观察，疗效显著。手术由英国伦敦大学学院眼科研究中心及附属眼科医院研究小组操刀，共有3名先天莱贝尔黑内障患者接受治疗。手术中，医生需轻抬位于患者眼球后方的视网膜，使视网膜与眼球短暂脱离，并将正常RPE65基因注入视网膜下方，以取代变异基因。

在伦敦大学学院附属眼科医院实施该手术8个月后，美国宾夕法尼亚大学也进行了同样的视网膜基因注射手术。英国研究小组负责人、伦敦大学学院眼科研究中心人类分子基因学教授罗宾·阿里在研究报告中写道：“这是一座意义重大的里程碑。这项实验为其他遗传性视网膜疾病基因疗法开创先河，同时为基因疗法应用于更多眼疾奠定基础。”（转化医学网360zhyx.com）

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