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2017年12月19日，FDA批准了全球首款体内基因治疗药物Voretigene Neparvovec（Luxturna®），这在基因治疗领域创造了历史。Luxturna用于治疗Leber先天性黑蒙2型（LCA2）的患者，这是一种由RPE65基因突变引起的遗传性视网膜疾病（IRD），导致出生时视力严重受损，然后缓慢进行性视网膜光感受器变性。此外，它还能够治疗其他由RPE65突变引起的遗传性视网膜疾病，比如视网膜色素变性(RP)。
视网膜疾病一直在基因疗法转化的最前沿
之所以成为基因治疗的风口之一，也不是没有道理的。与血友病类似，原因有很多。
首先，眼睛是封闭的，而且由于存在物理屏障，包括血 - 视网膜屏障和独特的眼内微环境对免疫反应的局部抑制，使其具有相对的免疫豁免。这些特征阻止病毒载体的全身传播，以及免疫系统对载体组分和/或转基因产物发生反应。
另外，由于视网膜细胞在出生后不会增殖，因此即使在转基因没有整合的情况下，单次注射载体也可促使转基因的无限长期表达。这种特征加上眼睛的小尺寸使其成为非常有吸引力的靶组织，因为仅需要少量的重组载体来进行治疗，对研究者来说不仅研究成本得到了降低，并且克服了临床转化后大规模病毒载体生产所带来的挑战。
在视网膜疾病的基因治疗开始研究之前，就已经开发出成熟的人类视网膜外科手术流程。此外，许多IRD的小型和大型动物模型都可作为治疗功效的概念验证，也已经开发出非侵入性和重复监测视网膜状态的方法用来长期评估基因治疗的功效。
IRD基因治疗（图片来源：GenSight）
相关递送载体的研究
视网膜基因递送载体的研究可以追溯到20世纪90年代中期。最初，鉴定的第一种载体是腺病毒（Ad），用于测试其转导视网膜色素上皮细胞（RPE）和光感受器的能力。在视网膜下注射后，发现RPE被有效转导，而光感受器似乎难以用Ad转导并且需要更高的载体剂量。
然而，进一步的研究表明，在新生儿视网膜和退化前状态的IRD动物模型中，Ad递送基因向光感受器的转导增强，这可能是由于物理屏障减少。不久之后，研究人员第一次证明使用Ad载体成功在rd1小鼠模型中进行基因治疗，该模型是由cGMP磷酸二酯酶的β亚基突变引起的隐性遗传性视网膜变性。
同时，也开始评估其它病毒载体用于视网膜的基因转导。与Ad类似，视网膜下给予基于HIV 1型的慢病毒（LV）载体能有效转导RPE和光感受器，并且在新生儿中比在成年大鼠中获得更高的效率。而使用AAV载体则获得了在光感受器转导方面更有希望的结果，证明了视网膜下注射后光感受器和RPE都有高效的转导。
在接下来的几年中，数十种Ad、AAV血清型和LV假型得到了评估，以寻找视网膜基因治疗的最佳候选载体。尽管做了很多努力，但迄今为止，测试的基于Ad和LV的载体都没有达到用AAV载体实现的光感受器转导水平。一种可能的解释是，大尺寸的Ad和LV颗粒会产生空间限制，阻碍病毒通过***视网膜的物理屏障进行扩散。
最近，非病毒载体已被考虑用于视网膜的基因递送，并且被证明在一些IRD动物模型中至少短期内是有效的。但值得关注的是转导效率和治疗效果的持续性，特别是在大型动物模型中，因为这也是限制非病毒载体应用于广泛开发基因治疗策略的重要原因。
治疗不同形式的失明
继该首款体内基因治疗药物之后，许多生物技术公司正在推进他们自己的技术来修复导致失明的不同突变。
正在进行的临床试验（图片来源：Cell）
挑战一
大基因的转导
许多转基因太大而无法有效地包装在AAV载体中，其载货量限制在大约5kb的DNA。因此，已经做出相当大的努力来确定扩展AAV转移能力的策略。
下图是其中一种策略，转基因可以分成两个独立的AAV载体，在共同感染相同细胞后，通过两个AAV之间的分子间重组可重建全长基因的表达。此外，例如激酶抑制剂与AAV的联合递送，可以改善单个或多个AAV转导的效率。
使用两种单独的腺相关病毒（AAV）载体将大基因的5'（橙色）和3'（浅蓝色）两半递送至光感受器，通过两种AAV载体基因组之间的重组，在由两种载体转导的光感受器的细胞核中重构成全长基因（图片来源：Cell）
大基因递送至视网膜的替代方案可以是LV载体，其具有比AAV载体更大的基因组容量。尽管LV转导光感受器的能力仍然受到质疑，但针对分别由ABCA4和MYO7A大基因引起的斯特格氏病和Usher综合征1B型，已经推出了几项涉及LV载体递送的I/II期临床试验。相信这些试验的结果将会为LV对IRD基因治疗的适合性提供重要数据。
挑战二
注射的侵入性
视网膜基因治疗中一个重要且仍存在争论的问题是，在经历退行性病变过程的脆弱视网膜中，是否应避免视网膜下注射导致RPE从下面的光感受器瞬时脱离。当视网膜下注射涉及视网膜最薄且最脆弱的中央凹时，这个问题尤其重要，这对于中央视觉至关重要。因此，正在评估其它的替代给药方式，如玻璃体内注射，以求侵入性最小且可能因此更安全。
玻璃体内注射（图片来源：Cell）
挑战三
显性遗传
对于隐性遗传病（如LCA2），向体内递送缺失基因就足以发挥治疗效果。但对于显性遗传病，仅转入正常基因不够，还需要首先将能产生毒性产物的突变基因纠正或用正常基因替代。
大于30%视网膜色素变性（RP）的患者是常染色体显性遗传的，其中视紫红质（RHO）的突变是最常见的形式。RHO是光感受器中最丰富的蛋白质，并且在低于内源性50％的水平下的替代可能将通常轻微的显性疾病转变为更严重的隐性疾病，因此这对基因治疗精确性的要求可能很高。
新一代的基因组编辑工具，如锌指核酸酶、TALE核酸酶和CRISPR/Cas9，允许在其基因座上修饰基因，似乎特别适合治疗常染色体显性遗传RP。目前，CRISPR/Cas9在对包括IRD在内的多种疾病的治疗应用的研究正在显著增加。理论上，CRISPR可以在我们的细胞中直接修复导致失明的突变，Editas Medicine正在与Allergan合作开发一种针对 Leber先天性黑朦引起的失明的CRISPR疗法。
然而，基因编辑的主要问题之一是诱导非预期的脱靶突变的可能性。这个问题在有丝分裂后组织中尤其重要，例如光感受器，AAV介导的Cas9表达在单次视网膜下注射后将长期持续，从而增加脱靶效应的危害。此外，基因组编辑的效率仍然相对较低，因此在将其应用于IRD之前，还需要优化光感受器转导或校正效率。
基因编辑策略（图片来源：Cell）
未来可期
在过去的25年里，视网膜基因治疗的发展取得了重大进展。在未来几年，我们可以期待越来越多的基因治疗产品进入市场，为许多面临无药可选的患者提供全新的治疗方案。尽管还面临着很多挑战，但随着技术的进步，更有效、更安全且成本更低的新技术肯定会到来。
基因治疗可能需要很长时间才能成为能够真正治愈多种导致失明疾病的主流治疗方法。但针对少数具有特定突变和罕见疾病的患者来说，基因治疗可能是走向光明的唯一道路。
参考出处：
https://doi.org/10.1016/j.molmed.2018.06.006
https://labiotech.eu/features/gene-therapy-blindness-cure/
（本文转自医麦客） |
